Anwendung der Metabolomik bei Urolithiasis: Entdeckung und Verwendung von Succinat

Signal Transduction and Targeted Therapy Band 8, Artikelnummer: 41 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Unter Harnstein versteht man eine chronische Stoffwechselstörung, die durch symptomatische Steinereignisse gekennzeichnet ist. Es hat sich gezeigt, dass das Vorkommen von Calciumoxalat-Monohydrat (COM) während der Steinbildung durch Kristallwachstumsmodifikatoren reguliert wird. Obwohl Kristallisationshemmer seit Jahrzehnten als therapeutische Methode anerkannt sind, wurden bei der Entdeckung wirksamer Modifikatoren zur Behandlung von Steinerkrankungen nur begrenzte Fortschritte erzielt. In dieser Studie haben wir Metabolomics-Technologien eingesetzt, einen leistungsstarken Ansatz zur Identifizierung von Biomarkern durch Screening der Urinkomponenten der dynamischen Progression in einem Blasensteinmodell. Durch eingehendes Sammeln und Analysieren von Metabolomics-Daten haben wir fünf unterschiedliche Metaboliten gescreent. Durch Untersuchungen zur Dichtefunktionaltheorie und Massenkristallisation haben wir herausgefunden, dass drei von ihnen (Salicylursäure, Gentisinsäure und Succinat) die Keimbildung in vitro wirksam hemmen können. Wir haben dabei die Wirkung der Inhibitoren anhand eines EG-induzierten Rattenmodells für Nierensteine untersucht. Insbesondere Succinat, ein wichtiger Akteur im Tricarbonsäurezyklus, könnte im Modell die Kalziumablagerung und -verletzung in den Nieren verringern. Die transkriptomische Analyse zeigte außerdem, dass die Schutzwirkung von Succinat hauptsächlich auf der Entzündungshemmung, der Hemmung der Zelladhäsion und der osteogenen Differenzierung beruhte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Succinat eine neue Therapieoption für Harnsteine darstellen könnte.

Urolithiasis ist eine relativ typische urologische Erkrankung, deren weltweite Prävalenz in den letzten Jahrzehnten kontinuierlich zugenommen hat.1 Es handelt sich außerdem um eine Krankheit mit einer 5-Jahres-Rückfallrate von bis zu 50 %.2 Die Ätiologie der Urolithiasis ist komplex und kann durch beeinflusst werden Fettleibigkeit, Diabetes, Bluthochdruck und metabolische Syndrome.3 Calciumoxalat (CaOx)-Steine machen über 75 % der Harnsteine aus, gefolgt von Harnsäure-, Calciumphosphat-, Struvit- und Cystin-Typen.4 Urolithiasis ist ein mehrstufiger Prozess Die Entstehung, das Wachstum und die Aggregation von Kristallen sind beteiligt, obwohl der zugrunde liegende Mechanismus noch nicht vollständig geklärt ist.5 Wie man Urolithiasis hemmen und das zugrunde liegende Risiko vorhersagen kann, blieb eine große Herausforderung.6

Die Heterogenität der Steinarten bei den Patienten erfordert ein personalisiertes Behandlungsmanagement, das eine Ernährungsregulierung/Wasseraufnahme, die Verabreichung verschiedener Arten von FDA-zugelassenen Medikamenten und einen chirurgischen Eingriff zur Entfernung der Steine umfassen kann.7 Heutzutage sind die Probleme mit dem Wiederauftreten von Urolithiasis und Die Prävalenz erregte immer noch große sozioökonomische Aufmerksamkeit. Daher ist die Suche nach neuen Behandlungsmethoden notwendig.8

Neben der Suche nach Medikamenten zur Vorbeugung und Behandlung von Steinen haben Modifikatoren, die die Kristallisation beeinflussen können, zunehmende Aufmerksamkeit erregt.9 Die wirksamsten Modifikatoren von Kalziumsteinen bestehen aus Carbonsäure- und Sulfatfunktionsgruppen, die mit der Kristalloberfläche interagieren können und/oder Komplex mit freien Ionen im Urin.10 Viele natürliche und synthetische Arten können sein Wachstum hemmen. Es ist jedoch immer noch sehr schwierig, die In-vitro- und In-vivo-Beweise miteinander zu verbinden. Die Kombination aus experimentellen Studien, Tierstudien und klinischen Studien könnte unsere Erkenntnisse über die Modifikation des Kristallwachstums und seine Funktion bei der Kristallisation erleichtern.5 Bisher wurde dies nur bei zwei Molekülen, nämlich Polyacrylsäure und einem zweiwertigen Inositphosphatmolekül,10,11 nachgewiesen hemmen die CaOx-Kristallisation, indem sie die renale CaOx-Ablagerung reduzieren.

Die Pathogenese der Urolithiasis ist mit vielen metabolischen und äußeren Faktoren verbunden. Obwohl der Mechanismus noch nicht vollständig geklärt ist, ist es zweifellos eine Tatsache, dass er von der Zusammensetzung des Urins beeinflusst wird.4 Urin ist eine Art komplexe Mischung reichlich vorhandener molekularer Spezies, einschließlich sowohl Inhibitoren als auch Promotoren für die Entwicklung von Nierensteinen.12 Nephrolithiasis hat eine hohe Häufigkeit Auftreten bei Spinal-Bifida-Patienten, die nach der Augmentation an Blasensteinen litten.13 Stoffwechselstörungen stehen in engem Zusammenhang mit nichtinfektiösen Steinen.14 Die Beurteilung der einzigartigen Wirkung(en) der Inhibitoren ist für die Urinkomplexität, zu der etwa 3100 niedermolekulare Metaboliten gehören, sehr schwierig Die Hälfte davon konnte nicht identifiziert werden. Urin enthält etwa 1823 Proteine, darunter 671 kürzlich identifizierte Bestandteile.15

Die Metabonomik untersucht hauptsächlich niedermolekulare Substanzen in Zellen und Geweben. Diese Stoffe stehen in engem Zusammenhang mit der Gesundheit des Körpers und werden hauptsächlich durch den Stoffwechsel verschiedener Stoffe unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen gewonnen. Gegenwärtig erfahren niedermolekulare Substanzen im Bereich der personalisierten Therapie große Aufmerksamkeit und werden zum Eckpfeiler der Biomarker-Forschung.16,17 Im Bereich der Nierenforschung ist die Metabonomics weit verbreitet und hat bemerkenswerte Ergebnisse erzielt wurden auch zur Untersuchung neuer Marker für die Diagnose von Nierenerkrankungen eingesetzt.18 Mit der rasanten Entwicklung der Bioinformationstechnologie erweitert sich auch der Anwendungsbereich der Metabonomics-Technologie. Beispielsweise wurde es im Bereich der Erforschung von Krankheitsmechanismen und der Zielauswahl eingesetzt. Darüber hinaus haben Metabonomics-Methoden auch einen hohen Anwendungswert im Bereich der CaOx-Stein-Tiermodellforschung, durch die viele abnormale Stoffwechselwege identifiziert wurden.19 In jüngster Zeit wurde der Metabonomics-Ansatz auch zur Untersuchung des Urins von Patienten mit Nierensteinen verwendet, bei denen es sich möglicherweise um Nierensteine handelt hohen Stellenwert für die Therapie dieser Erkrankung.20

Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass sich die Steine immer in der frühen Phase (1–2 Wochen) nach der Blasenvergrößerung in der Kaninchenblase bilden und sich im Laufe der Zeit entweder auflösen oder weiterentwickeln können.21 Das Verschwinden von Harnsteinen war ebenso rätselhaft wie die Steine war viel größer als der Umfang der Kaninchenharnröhre und es war schwierig, ihn autonom auszuscheiden, bis eine kürzlich durchgeführte Studie an CaOx-Kristallen einen neuen Hemmweg entdeckte, der mit sehr wenigen Modifikatoren zur Steinauflösung führen kann.22 Identifizierung der neuen Kristallinhibitoren Wir haben die Urinproben sowohl des Blasensteinmodells als auch der normalen Kontrolle mithilfe ungezielter Metabolomik analysiert, mit dem Ziel, neue Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren und die In-vitro- und In-vivo-Entdeckungen zu überbrücken.

Wir haben PC-SIS (Procyanidine vernetzte Dünndarm-Submukosa) verwendet, um die Blasendefekte in voller Dicke in einem Kaninchenmodell für Blasensteine zu reparieren.21 Die Ultraschalluntersuchung ergab starke Echos und Schatten im Lumen der Harnblase aller Modelltiere nach 2 Jahren Wochen (Abb. 1b). Der Kalkül wurde geerntet, um die Größe, Verteilung und Komponente zu visualisieren. Aus den Abbildungen 1c und d geht hervor, dass die Steine eine unregelmäßige Form mit einer beigefarbenen Oberfläche hatten, während das Ergebnis der Ultraschalluntersuchung des Abdomens weitgehend mit dem groben Erscheinungsbild der Steine übereinstimmte. Im FTIR-Spektrum, das eine zuverlässige Charakterisierung ermöglicht und die Zusammensetzung der Harnsteine auf atomarer Ebene hervorhebt (Abb. 1d), sind CaOx und Hydroxylapatit (HAP) typische Bestandteile der Proben. Die Absorptionsbanden bei 1036 cm-1 sind auf die HAP-Streckung zurückzuführen, während die bei 660 cm-1 möglicherweise den COM-Schwingungen entsprechen. Die diagnostischen Banden von 1643 cm−1 (C = O-Schwingung) und 780 cm−1 (CC-Streckung) sind charakteristisch für Calcium. Wie festgestellt wurde, hat Calciumoxalat-Dihydrat (CSB) einen wesentlichen Beitrag zur Probe geleistet.23 Durch biochemische Urinanalyse (Abb. 1e, f) ist der Calciumspiegel zwei Wochen nach der Operation deutlich angestiegen. Im Gegensatz dazu unterschied sich die Konzentration des Blutkalziums zwischen dem Modelltier und den normalen Kontrollen nicht.

Die dynamischen Veränderungen der Stein- und Komponentenanalyse. a, b Repräsentative Bilder der Blase mittels Ultraschall des Abdomens der normalen Kontrolle und Blasensteinmodell nach 2 und 4 Wochen. c Makroaufnahme und Ultraschall des Abdomens der Steinprobe derselben Person. d Infrarotspektren und grobe Morphologie des Steins. e, f Quantifizierung des Calciumspiegels in den Urin- und Blutproben. *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Für (e–f) ist n = 10 Kaninchen in jeder Gruppe

Bemerkenswert ist, dass bis zu 70 % der Steine nach 4 Wochen verschwunden sind (Abb. 1b). Die Harnröhrengröße erwachsener Kaninchen schwankt bei unterschiedlichem Harnröhrendruck zwischen 4 und 10 mm, was viel kleiner ist als die Größe des Steins, es ist schwierig, ihn spontan auszuscheiden (Ergänzungstabelle 1).24 Die Bildung von Harnsteinen unterliegt mehreren Prozessen die Kristallkeimbildung, Kristallbildung und Aggregation beinhaltet, wobei letztere durch Kristallinhibitoren und -promotoren reguliert wird.25 Mikroskopische Analysen ergaben Hinweise darauf, dass die Auflösung hauptsächlich während des mineralogenetischen Prozesses von Nierensteinen stattgefunden hat.26 Dies steht im Widerspruch zu der weit verbreiteten Vorstellung, dass die Steine kann sich nicht auflösen,27,28 und eröffnete ein neues Paradigma für klinische Ansätze, bei denen eine gezielte In-vivo-Auflösung den schädlichen Einfluss der Steinkrankheit lindern kann. Dies hat uns inzwischen auch dazu veranlasst, darüber nachzudenken, ob die dynamischen Veränderungen des Zahnsteins auf das Vorhandensein von Kristallmodifikatoren im Urin zurückzuführen sind. Als komplexe Mischung von Metaboliten enthält der Urin etwa 3100 kleine Moleküle mit einigen aktiven Modifikatoren (Kristallinhibitoren sowie Promotoren).29 Daher ist es schwierig, die Inhibitoren zu identifizieren, die die pathologische Steinentwicklung beeinflussen können.

Das wahrscheinliche Vorhandensein von Kristallmodifikatoren deutet darauf hin, dass einige natürliche Urinzusammensetzungen, einschließlich Metaboliten, das Kristallwachstum und die Steinbildung beeinflussen können.29 Um die einzigartige(n) Wirkung(en) von Inhibitoren weiter zu untersuchen, haben wir eine ungezielte Metabolomikanalyse an 50 unabhängigen Urinen durchgeführt Proben von normalen Kontrollen (10 Proben) und Blasensteinmodellen (10 Proben) zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 2, 3 und 4 Wochen nach der Blasenvergrößerungsoperation) (Abb. 2a). Aus Abb. 2b geht hervor, dass negative Metaboliten anhand der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) klar zwischen der normalen Kontrollgruppe und der chirurgisch behandelten Gruppe getrennt wurden. Zu diesem Zweck haben wir uns auf die negativen Metaboliten konzentriert und die Trennung zwischen der Kontrolle und dem Modell zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation durch PLS-DA-Analyse quantifiziert und einen offensichtlichen Unterschied zwischen den beiden Profilen entdeckt (ergänzende Abbildung 1). Durch paarweise (ergänzende Abbildung 1) und Mehrfachgruppenvergleiche (Abbildung 2c) durchgeführte Signalweganalysen haben die ABC-Transporter, den Lysinabbau, den Phenylalaninstoffwechsel und den Tyrosinstoffwechselweg als signifikante Anreicherung im KEGG identifiziert. Um die an den angereicherten Signalwegen beteiligten Metaboliten weiter abzugrenzen, haben wir die Heatmaps der Kontroll- und Modellgruppen für die vier Signalwege aufgezeichnet (Abb. 2d und ergänzende Abb. 1), um den Unterschied in den Metaboliten zwischen den beiden Gruppen aufzuzeigen.

Metabolomics-Profiling hat fünf organische Moleküle als Kandidaten für Kristallinhibitoren identifiziert. ein Schema, das den Aufbau von Metabolomics-Profiling-Experimenten darstellt. b Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) für die positiven und negativen Ionen des Kontroll- und Modelltiers basierend auf Metabolitenprofilen der Urinproben. c KEGG-Signalweganreicherungsanalyse der Kontroll- und Modellgruppen. d Heatmap von ABC-Transportern, Lysinabbau, Phenylalaninstoffwechsel und Tyrosinstoffwechselweg. e Veränderung der fünf organischen Moleküle basierend auf Metabolitenprofilen und statistischer Analyse, *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Für (a–e) ist n = 10 Kaninchen in jeder Gruppe

Polyprotische organische Stoffe und Kristalle können durch Elektrostatik im Calciummineralisierungssystem interagieren, wobei das Kriterium für die Auswahl eines wirksamen Inhibitors ein Molekül mit mehreren geladenen Gruppen ist.30 Tatsächlich enthielten einige der wirksamsten Inhibitoren für Calciumkristalle Carboxylat (–COOH), funktionelle Hydroxyl- (–OH) und/oder Sulfatgruppen (–OSO3–), die mit der Kristalloberfläche im Urin interagieren können.31,32 Wir haben daher auf der Grundlage der Heatmaps-Analyse fünf Moleküle mit funktionellen Gruppen ausgewählt, darunter Taurin (–OH), Suberinsäure (–COOH), Succinat (–COOH), Salicylursäure (–COOH, –OH) und Gentisinsäure (–COOH, –OH) aus den unterschiedlich exprimierten Metaboliten zur weiteren Analyse (Abb. 2e). Die statistische Analyse zeigte, dass die Änderung des Gehalts an organischen Säuren keine offensichtliche Regelmäßigkeit aufwies, was darauf hindeutet, dass sie verschiedene Rollen bei der Kristallmodifikation gespielt haben.

Mithilfe der Dichtefunktionaltheorie (DFT) wurde die Wirkung der Modifikatoren beleuchtet. Die Adsorptionsenergie des Modifikators auf der COM (100)-Oberfläche war Gentisinsäure > Salicylursäure > Bernsteinsäure > Suberinsäure > Taurin. Die Bindungsenergien der Modifikatoren auf der COM (021)-Oberfläche stimmten mit denen der COM (100)-Oberfläche mit Ausnahme von Salicylursäure und Suberinsäure überein (Ergänzungstabelle 2). Im Vergleich zu anderen Modifikatoren war die Stärke der Bindung zwischen Gentisinsäure und der COM (100)- und (021)-Oberfläche (Abb. 3b, c) größer. Um die Stärke der an COM-Oberflächen (100) und (021) gebundenen Modifikatoren zu quantifizieren, haben wir die mittlere Verschiebung δ der Atome berechnet (Ergänzungstabelle 3). Das Ergebnis zeigte, dass die Adsorption aller Modifikatoren auf der (100)-Oberfläche im Vergleich zur (021)-Oberfläche zu einer höheren Spannung geführt hat. Die Bindung von Gentisinsäure an die COM-Oberfläche hat zur höchsten Dehnung geführt (100 δ = 0,418 Å; 021 δ = 0,206 Å). Im Gegensatz dazu weist Taurin die geringste Dehnung auf (100 δ = 0,211 Å; 021 δ = 0,099 Å). Es wurde zuvor gezeigt, dass die Spannung des Kristalls bei konstanter Zugspannung seine Wachstumsrate verringern kann. Dies lässt auch darauf schließen, dass die Wirkung von Gentisinsäure bei der Verhinderung des Kristallwachstums besser ist als die von Taurin.22,33

Bindungsenergie der Modifikatoren auf der COM-Oberfläche und Ca2+. a Die optimierten Strukturen von COM, Taurin, Suberinsäure, Bernstein-, Salicylur- und Gentisinsäure. b, c Optimierte Strukturen der Moleküle auf der COM (100)- und COM (021)-Oberfläche, wobei die hellrosa, hellblauen, braunen, blauen, gelben und roten Kugeln H, Ca, C, N, S bezeichnen bzw. O-Atome. d Röntgenphotoelektronenspektren (XPS) von Taurin, Suberinsäure, Bernstein-, Salicylur- und Gentisinsäure, adsorbiert an Ca2+. Die angepassten Peaks in Blau, Rosa und Rot entsprechen den C1s-Peaks von C = O, C–O bzw. C–C

Zusätzlich zu den COM-Oberflächeninteraktionen wurde in dieser Studie auch die Koordination von Modifikatoren mit Ca2+ analysiert (Ergänzungsabbildung 2a, Ergänzungstabelle 4). Die Berechnungen zeigten, dass Gentisinsäure, Salicylursäure und Succinat im Vergleich zu Suberinsäure und Taurin eine höhere Affinität zum Ca2+-Ionenkomplex aufwiesen. Die Bindung von Gentisinsäure an Ca2+ war am energischsten. Die Wechselwirkungstypen von Modifikatoren und Ca2+ wurden anhand der XPS-Spektroskopie nachgewiesen (Abb. 3d, ergänzende Abb. 2b und Tabelle 5). Die Bindungsenergie in der XPS-Spektroskopie beruht auf einer winzigen chemischen Verschiebung, die durch Atomladungen verursacht wird. Daher hängt es mit der Netto-Atomladung zusammen.34 Wir haben uns auf die Änderungen in den Peaks der organischen Säure Calcium und der organischen Säure C1s mit C = O konzentriert, die mit Ca2+ interagieren können. Der Änderungsbereich des C = O der organischen Säure und des Kalziums der organischen Säure spiegelte die Größe der Bindungsenergie und den Änderungstrend wie folgt wider: Gentisinsäure > Salicylursäure > Succinat > Suberinsäure > Taurin mit demselben Trend wie DFT-Berechnungen. Angesichts der Vielfalt der Hemmwirkungen der Modifikatoren müssen wir die Hemmwirkung der Modifikatoren durch In-vitro- und In-vivo-Experimente weiter nachweisen.

Mit oder ohne Modifikatoren wird die Massenkristallisation durch ein Mikroskop erfasst, um die entsprechenden Änderungen in der Kristallgröße und -morphologie zu bestimmen. Bei dieser Technologie ist bei der Analyse der Kristallisation kein Invasionsvorgang erforderlich, um die Wirkung des Modifikators effizienter und genauer zu analysieren. Bei der optischen Mikrofotografie zeigten Taurin und Suberinsäure im Vergleich zur Kontrolle keinen erkennbaren Einfluss auf die Kristallmorphologie und -fläche. Im Gegensatz dazu haben Succinat, Salicyrin- und Gentisinsäure klassische tetragonal geformte Kristalle erzeugt (Abb. 4a, b). Dies spiegelt die Hemmung der Kristallwachstumsrate und die zugrunde liegende Unterdrückung der COM-Keimbildung wider (Abb. 4b, 4c). Der klassische Mechanismus des Kristallwachstums umfasste die zweidimensionale Schichtkeimbildung und das schrittweise Fortschreiten über Kristallebenen hinweg. Das Vorhandensein von Inhibitoren auf der Kristalloberfläche kann die Bildung und das Wachstum der Kristalle behindern.35 Rasterkraftmikroskopie (AFM) der Kristalloberflächentopologie (Abb. 4e) zeigte, dass die Kontroll- und Taurinkristalle die geringsten Tiefenänderungen (innerhalb von 3) aufwiesen nm), obwohl es Defekte auf der Kristalloberfläche gibt. Nach dem Eingriff mit Gentisinsäure und Succinat ist ein deutliches Kristallwachstum zu erkennen. Der Oberflächenfehler der mit Gentisinsäure behandelten Kristalle war mit einer Reichweite von etwa 8 nm am größten. Während der Wachstumsschritte können in Succinatkristallen tiefe regelmäßige Risse (Tiefe: 5 nm) beobachtet werden, die möglicherweise darauf zurückzuführen sind, dass die Kristallinhibitoren die Richtung des Kristallwachstums geändert haben und darüber hinaus zu einer verringerten Stabilität der Kristallstruktur geführt haben.

Hemmung der COM-Keimbildung in vitro. a Optische (Maßstabsbalken: 20 μm) und REM-Aufnahmen (Maßstabsbalken: 2 μm und 4 μm). b–d Semiquantitative Analyse der kristallisierten Fläche sowie der Anzahl und des Verhältnisses von COM und CSB (COM – CaOx-Monohydrat, COD – CaOx-Dihydrat, nd – nicht definiert), *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. e AFM-Bilder des (001)-Oberflächenwachstums und der Hemmung mit oder ohne Modifikator (Maßstabsbalken: 400 nm). f FTIR-Spektren mit oder ohne Modifikator

Während sich die bisherigen Studien hauptsächlich auf den Einfluss von Inhibitoren auf die COM-Kristallisation konzentrierten, konzentrierte sich unsere Analyse überwiegend auf die Induktion von COM und COD. Um Letzteres zu bewerten, haben wir das Verhältnis von COM gemessen. Wie in Abb. 4d gezeigt, haben sowohl Taurin als auch Suberinsäure die COM-Keimbildung im Vergleich zur normalen Kontrolle (36 % ± 8 %) deutlich gefördert (52 % ± 5 % bzw. 49 % ± 15 %). Succinat, Salicyrin- und Gentisinsäure führten alle zu einer COM-Keimbildung von <30 % und einer CSB-Keimbildung von >37 % im Vergleich zur normalen Kontrolle (13 % ± 2 %), was ihre hemmende Wirkung auf die COM-Keimbildung bestätigte. FTIR-Experimente (Abb. 4f) zeigten auch eine Verschiebung von der überwiegend COM- zur überwiegend COD-Kristallisation mit Succinat, Salicyrin- und Gentisinsäure im Massenkristallisationssystem. Der Absorptionspeak bei 660 cm−1 im Fingerabdruckbereich zeigte an, dass der Großteil der Kristallphase COM war. Darüber hinaus waren 914 und 780 cm−1 Absorptionspeaks von CSB. Die FTIR-Spektren der Tauringruppen waren ähnlich, wobei die charakteristischen Absorptionspeaks bei 660 cm−1 darauf hindeuteten, dass der Großteil der Kristallphase des CaOx-Kristalls COM war. Nach der Zugabe von Salicylursäure, Suberinsäure, Gentisinsäure und Succinat haben sich die Absorptionspeaks der Kristalllösung von 1617 und 1322 cm−1 auf 1643 und 1330 cm−1 verschoben, was darauf hindeutet, dass die Zugabe von Modifikatoren zu einem erhöhten CSB geführt hat stimmte mit der Charakterisierung der Kristallmorphologie überein.36 CaOx-Kristalle haben zwei häufige Formen: COM und COD. CSB wird bei Instabilität weniger gebunden, und COM bindet sich leichter an Nierenepithelzellen und kann zu Steinen aggregieren.37 Eine Methode zur Unterdrückung der Steinbildung könnte daher darin bestehen, Modifikatoren zu testen, die sowohl auf die CaOx-Kristallisation abzielen als auch diese induzieren können Bildung von CSB. Im Vergleich zur Kontrolle lässt die erhöhte Instabilität der CSB-Kristalle durch die Zugabe von Succinat, Salicylursäure und Gentisinsäure auf eine mögliche Rolle bei der Behandlung von Nierensteinen schließen.

Wir haben Modifikatoren mit In-vitro-Kristallhemmung (Salicylursäure, Gentisinsäure und Succinat) ausgewählt, um zu beurteilen, ob polyprotische organische Stoffe einen Einfluss auf die EG-induzierte Kristallbildung haben. Als Interventionsgruppe wurde Zitronensäure, der Hauptbestandteil des Steininterventionsmittels Ulaite, eingesetzt. Sprague-Dawley-Ratten wurden durch tägliche Sondenernährung mit Inhibitoren (200 mg/kg) oder 0,9 % NaCl behandelt. In der Zwischenzeit akzeptierten Ratten der Versuchsgruppe und der Modellgruppe 1 % EG-Lösung, um die Kristallbildung zu induzieren. Vier Wochen später wurden das grobe Erscheinungsbild (Abb. 5a) und das Gewicht (Abb. 5c) der Rattennieren sowie das Körpergewicht (Abb. 5b) analysiert, um den Grundzustand der Ratten zu beurteilen. Sowohl Zitronensäure als auch Succinat zeigten eine schützende Wirkung im EG-induzierten Rattenmodell. Die Succinat-Interventionsgruppe hatte ein ähnliches Aussehen, Gewicht und Körpergewicht der Nieren wie die normale Kontrollgruppe, wohingegen Salicylursäure und Gentisinsäure keine signifikante Wirkung auf den Nierenschutz zeigten . Während mit NaCl, Salicylursäure und Gentisinsäure behandelte EG-induzierte Rattenmodelle innerhalb von 4 Wochen Steine entwickelten, zeigten die mit Zitronensäure und Succinat behandelten Modelle eine signifikante Hemmung der Steinbildung sowie einen niedrigeren Blut-BUN- und Plasma-Kreatinin-Spiegel (Abb. 5d – h). ).

Succinat hat im EG-behandelten CaOx-Kristallisationsmodell der Ratte die Ablagerung und Schädigung von Nierenkristallen reduziert. a Grobes Erscheinungsbild der Nieren. b, c Körper- und Nierengewicht, *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # P < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. d Mikro-CT-Bildgebung, e, f Abschnitte der Rattenniere wurden durch Von-Kossa-Färbung auf Kristallablagerung gefärbt (Maßstabsbalken: 400 μm) und die dunklen Bereiche des Kristalls wurden quantifiziert, # P < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. g, h Plasmablut-Harnstoffstickstoff (BUN) und Kreatinin (CREA), *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # P < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe

Wir haben den Einfluss von Modifikatoren auf die Nierenfunktionen bei verschiedenen Rattengruppen weiter untersucht. Durch Von-Kossa-Färbung (Abb. 5e, f, ergänzende Abb. 3) gab es bei EG-behandelten Ratten reichlich Kristallkristalle im Grenzbereich zwischen Kortikalis und Medulla. Im Vergleich zu Zitronensäure, Salicylursäure und Gentisinsäure war die CaOx-Kristallablagerung in der Succinatgruppe nach der EG-Behandlung offensichtlich geringer (P < 0,05). Eine Nierenschädigung wurde mittels Periodic Acid-Schiff (PAS)-Färbung erkannt und auf tubuläre Schädigung hin bewertet (ergänzende Abbildungen 4a, 4b). Wie erwartet wurde die Nierenschädigung bei 4 Wochen lang mit Succinat angereicherter Diät im Vergleich zu mit EG behandelten Ratten deutlich reduziert. Bemerkenswerterweise wurde das Ausmaß der Nierenschädigung durch die Succinat-Behandlung im Vergleich zur Zitronensäure-Gruppe weiter reduziert, was auf einen stärkeren Oxalatausfluss aus dem Nierengewebe hindeutet, was mit der milderen Nierenschädigung übereinstimmt. Durch Immunhistochemie (IHC) waren die Intensitäten von CD44, IL-6 und OPN (ergänzende Abbildung 5) in den Tubuli der mit EG behandelten Gruppe höher reguliert als in der Kontrollgruppe. Die Verabreichung von Succinat hat die Expression von CD44, IL-6, deutlich gehemmt, was mit dem Ergebnis der histologischen und funktionellen Analyse übereinstimmt.

Der globale Einfluss von Succinat auf die Neuprogrammierung des Transkriptoms des Rattenmodells während der Kristallbildung wurde anhand der RNA-Sequenz von Nierengewebe gemessen, die 4 Wochen nach der EG-Behandlung gesammelt wurde. Signalweganalysen und Q-PCR-Ergebnisse legten nahe, dass differentiell exprimierte Gene (DEGs) in der Succinat-Gruppe für den Aminosäurestoffwechsel signifikant angereichert waren (Abb. 6a, c, ergänzende Abb. 7), während diejenigen in der Succinat-Gruppe signifikant angereichert waren Immunantwort und Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle (Abb. 6b, c, ergänzende Abb. 7) im Vergleich zum EG-behandelten Modell, das eine schützende Wirkung auf die Nierenverletzung ausübte. Durch RNA-seq-Analyse zeigte die EG-behandelte Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen eine ähnliche Anreicherung von Signalwegen einschließlich entzündungsfördernder, Adhäsionsmoleküle und Osteoklasten-Differenzierungszellen usw. in der Modellniere (ergänzende Abbildung 6a), jedoch in die entgegengesetzte Richtung im Hinblick auf den Aminosäurestoffwechselweg (ergänzende Abbildung 6b).

Umkehrung der EG-induzierten Nierenschädigung durch Succinat, wie durch RNA-Sequenzierung veranschaulicht. a, b Genontologie (GO)-Begriffsanreicherungsanalyse der biologischen Prozesse, die durch Succinat- und EG-Behandlung beeinflusst werden, basierend auf einem RNA-seq-Datensatz. Hoch- (links) und herunterregulierte Prozesse (rechts) in der mit Succinat behandelten Gruppe im Vergleich zur mit EG behandelten Modellgruppe. c Punktdiagramm, das den paarweisen GSEA-Signalwegvergleich des RNA-seq-Datensatzes der mit Succinat und EG behandelten Modellgruppe und der entsprechenden Kontrollen zeigt. Blaue und rote Punkte repräsentierten die herunter- bzw. hochregulierten Pfade. d Ein Streudiagramm, das die Änderung der Expressionsfalte von DEGs zwischen der EG-behandelten Modellgruppe und der Succinatgruppe basierend auf dem RNA-seq-Datensatz zeigt. e Heatmaps, die die Expression von Genen zeigen, die mit entzündlichen, apoptotischen und Überlebensereignissen im Rattennierengewebe der mit EG und Succinat behandelten Gruppen assoziiert sind, basierend auf der RNA-Seq-Analyse. Für (a–e) n = 3 Ratten in jeder Gruppe

Darüber hinaus wurde die verbessernde Funktion von Succinat bei Nierenschäden, einschließlich Entzündungsreaktion, Adhäsionsmolekülen und Osteoklastendifferenzierung, nach der EG-Behandlung weitgehend umgekehrt. Dies wurde durch eine Transkriptom-bezogene Heatmap-Analyse bestätigt, bei der die Veränderungen der Genebene in der Modellgruppe durch Succinat weitgehend rückgängig gemacht wurden. Wie gezeigt, waren Gene, die am Aminosäurestoffwechsel beteiligt sind, hauptsächlich in der Succinatgruppe angereichert. Im Gegensatz dazu zeigte das EG-behandelte Modell eine starke Korrelation mit der Nierenschädigung (dh Geninduktion) und einer Anreicherung von Genen, die mit Zellschäden verbunden sind (Abb. 6d, e). Streudiagramme und Heatmap-Analysen legten nahe, dass unter den DEGs die der Kontrollgruppen offensichtlich im Hinblick auf den zellulären Aminosäurestoffwechsel angereichert waren, während die in den Nieren der Modellgruppe herunterregulierten DEGs im Vergleich zur EG-behandelten Gruppe offensichtlich im Hinblick auf Adhäsionsmoleküle und Osteoklastendifferenzierung angereichert waren (Ergänzende Abb. 6d, e).

Zu den wichtigsten Ereignissen bei der Entstehung von Harnsteinen gehören Kristallkeimbildung, Kristallwachstum und Kristall-Zell-Adhäsion.38 Durch die gezielte Behandlung der Wechselwirkungsstellen auf der Kristalloberfläche können Kristallisationsinhibitoren einen alternativen Ansatz zur Reduzierung der Kristallwachstumsrate darstellen. Bisher gab es jedoch keine Behandlung für die CaOx-Kristallisation, die zur Behandlung von Harnsteinerkrankungen eingesetzt werden könnte.22,39 In dieser Studie haben wir durch Metabolomik auf der Grundlage der Theorie der Steinbildung (Blase) fünf potenzielle Steineingriffsmodifikatoren identifiziert Stein) zu Stein (Nierenstein). Unter diesen haben Bernsteinsäure, Salicylursäure und Gentisinsäure in vitro die Wirkung einer Kristallhemmung gezeigt. Bemerkenswert ist, dass Bernsteinsäure bei der Verwendung von Zitronensäure als Kontrolle zur Behandlung von EG-induziertem Nierenstein bei Ratten eine hervorragende Hemmung der renalen Kalziumablagerung sowie eine schützende Wirkung zeigte. Die transkriptomische Analyse hat außerdem gezeigt, dass die schützende Wirkung von Succinat hauptsächlich auf der Entzündungshemmung, der Hemmung der Zelladhäsion und der Osteogenese sowie der Regulierung des Aminosäurestoffwechsels beruht.

Kürzlich wurden verschiedene Modifikatoren des Kristallwachstums, am häufigsten Inhibitoren, entwickelt, die von kleinen Molekülen und Peptiden bis hin zu Proteinen reichten. Moleküle mit Carboxylat- und Phosphatfunktionsgruppen üben eine signifikante verhindernde Funktion auf das Kristallwachstum von COM aus.38,40 Basierend auf diesen Kriterien und einem strengen Screening zeigte eine eingehende Analyse von Nicht-Ziel-Metabolomics-Daten, dass Taurin, Suberinsäure, Bernsteinsäure und Salicylursäure Säure und Gentisinsäure mit Sulfat- und Carboxylatgruppen können mit der Kristalloberfläche interagieren und deren Wachstum beeinflussen. Der Vergleich der In-vitro-Wirksamkeit von CaOx-Kristallisationsinhibitoren ist aufgrund der unterschiedlichen Testmethoden und Parameter eine Herausforderung. In dieser Studie haben wir die theoretische DFT-Berechnung und COM-Massenkristallisationstests kombiniert, um die Hemmwirkung jedes Modifikators umfassend zu bewerten. Basierend auf dem Mechanismus, dass die Kristalloberflächenfärbung durch Inhibitoradsorption verursacht wurde.41,42 Die Belastung der Modifikatorbindung an COM-Oberflächen (100) und (021) zeigte, dass Gentisinsäure, Salicylursäure und Succinat die höchste mittlere Verschiebung (in Å) aufwiesen ), was darauf hinweist, dass die Kristallwechselwirkungen energiereicher sind als bei Taurin und Suberinsäure. Wir haben außerdem die Bindungsfähigkeit jedes Moleküls an Ca2+ berechnet, was dem Trend der XPS-Ergebnisse entsprach. Die Stärke der Bindungsfähigkeit kleiner Moleküle an Ca2+ hing hauptsächlich von der Elektronegativität des Sauerstoffs im C = O ab. Je stärker die Elektronegativität, desto stärker die Bindungsenergie an Ca2+. Die Ergebnisse des Kristallisationstests zeigten, dass Bernsteinsäure, Salicylursäure und Gentisinsäure die Größe und Anzahl der Kristalle verringern können, was mit früheren Studien zu Inhibitoren für die COM-Kristallisation übereinstimmt.43,44 Während der Kristallisation können Bernsteinsäure, Salicylursäure und Gentisinsäure dies tun verschieben COM in Richtung CSB-Kristallisation, was eine therapeutische Wirkung haben kann, da CSB eine geringere Affinität zu Epithelzellmembranmolekülen aufweist und dadurch die intratubuläre Retention verringern kann.11,45,46

Um die Wirkung von Kristallinhibitor auf Nierensteine in vivo zu untersuchen, haben wir ein EG-induziertes Rattenmodell konstruiert, bei dem EG verwendet wurde, um eine übermäßige Ablagerung von Oxalat in Nierentubuli zu induzieren. In den Nierentubuli ausgefälltes Oxalat ist der Hauptrisikofaktor für die Bildung von CaOx-Nierensteinen.47 Kristallinhibitoren und Citrat wurden auf die Rattenmodelle angewendet, um ihre Wirkung auf die Nierensteine zu bewerten. Unter diesen ist Citrat eine Art bekannter Inhibitor zur Hemmung der Bildung von Nierensteinen durch Kombination mit Ca2+-Ionen, was dazu führt, dass sich weniger freies Kalzium an Oxalat bindet.48,49 Veränderungen der Nierenmorphologie bei EG-induzierten Ratten wurden durch die Anwendung von Succinat verbessert. Wir fanden heraus, dass Succinat die EG-induzierte CaOx-Ablagerung dramatisch umkehrte und die Schädigung und Apoptose von tubulären Zellen reduzierte. Die zytoprotektive Wirkung von Succinat wurde in vivo durch verringerte Serumkreatininspiegel weiter bestätigt. Der Schutzmechanismus von Succinat auf die CaOx-Ablagerung und -Schädigung in den Nieren wurde durch RNAseq weiter untersucht. Eine auffällige Hochregulierung von Entzündung, Zelladhäsion und Osteogenese wurde durch EG-induzierte Nierenveränderungen verursacht. Das entzündungshemmende und osteogenisierende Succinat verhinderte fast vollständig die Veränderung der Genspiegel sowie die Hochregulierung von Genen, die mit dem Aminosäurestoffwechsel zusammenhängen. Succinat regulierte die Expressionsniveaus osteogenesebezogener Gene, einschließlich IL-1, IL-6 und OPN, herunter, was sehr eng mit Nierenschäden und CaOx-Ablagerung in vivo zusammenhängt.50,51 Die verringerte CaOx-Kristalladhäsion durch Herunterregulieren der Expression Die Konzentrationen von CD68 und CD44 können einen neuen Weg zur Hemmung der CaOx-Ablagerung in den Nieren darstellen.52 Die Ergebnisse rechtfertigen eine weitere Untersuchung der Schutzwirkung von Succinat auf Nierensteine und deren Modulation.53

In dieser Studie haben wir einen neuen Kristallinhibitor Succinat mit außergewöhnlicher Wirksamkeit identifiziert und dessen In-vivo-Wirkung auf die CaOx-Ablagerung gezeigt. Succinat erweist sich als wirksame Therapie zur Vorbeugung von Nierensteinen als vielversprechend. Bisher wurde nur eine Pilotstudie zum Nierensteinmodell bei Ratten durchgeführt, um die hemmende Wirkung auf die CaOx-Ablagerung und -Schädigung in den Nieren zu überprüfen. Die Wirkung von Bernsteinsäure auf andere Harnorgane, insbesondere die Blase, muss jedoch noch überprüft werden. Gleichzeitig wird es interessant (und wichtig) sein zu bestätigen, ob die Verabreichung von Succinat auch in anderen Tiermodellen das Fortschreiten von Nierensteinen unterdrücken und die Metabolomik von peripherem Blut und Urin verändern kann. In der Folgestudie sind vor prospektiven klinischen Studien mit Succinat in diesem Bereich ein besseres Verständnis der Stoffwechselwege von Succinat beim Menschen, ein optimales Dosierungsschema und eine bessere Verträglichkeit erforderlich. Wir sind auch sehr an den nachgelagerten Zielen von Succinat interessiert, die es wert sind, erforscht zu werden und einen Weg zur Weiterentwicklung seiner klinischen Umsetzung bieten könnten.

Calciumchlorid (CaCl2, 97 %), Natriumoxalat (Na2C2O4, 99,5 %), Zitronensäure (C6H8O7, 99 %), COM (CaC2O4·H2O), Salicylursäure (C7H6O3, 99 %), Succinat (C4H6O4, 99 %), Gentisinsäure (C9H9NO5, 98 %), Taurin (C2H7NO3S, 99 %), Suberinsäure (C8H12O4, 99 %), Natriumchlorid (NaCl, AR) und EG (C2H6O2, 99,8 %) wurden von Sigma Aldrich gekauft.

Alle Experimente wurden von der Ethikkommission der Sichuan-Universität genehmigt (Datensatznummer 2018190 A). Zwanzig männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (jeweils 2,5 ± 0,5 kg) wurden zufällig in die normale Kontrollgruppe und die Blasenstein-Modellgruppe aufgeteilt. Nach einer zweiwöchigen Quarantänezeit wurden die Versuchstiere vor der Operation 12 Stunden lang gefastet. Anschließend wurden sie durch eine Injektion von Pentobarbital-Natrium (2 ml/kg) anästhesiert. Um die Blase freizulegen, wurde im Unterbauch ein entsprechend großer Schnitt gemacht. Anschließend wurde die Blasenwand teilweise in voller Dicke entfernt und das erforderliche Modell des Defekts der hinteren Wand erstellt. Nach der Sterilisation wurde 1 mg/ml PC-SIS vollständig mit löslichem Nahtmaterial (5-0, Johnson, USA) 22 vernäht, um vier Nahtlinien (5-0 Monocryl) ohne offensichtlichen Unterschied zu erhalten, um die Defekte des Rückens zu markieren an der Wand und unterstützen die spätere Analyse. Der Muskel und die Haut wurden genäht. Nach der Operation wurden alle Versuchstiere wieder in den Käfig gesetzt und frei gefüttert. Penicillin wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen intramuskulär injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 2, 3 und 4 Wochen) wurde Kaninchenurin in einem Kaninchen-Stoffwechselkäfig für eine nicht gezielte Metabolomics-Analyse gesammelt. Urinproben wurden in 1,5-ml-EP-Röhrchen gesammelt und bei hoher Geschwindigkeit eine halbe Stunde lang bei 4 °C zentrifugiert. Die Proben wurden in einer Umgebung von –80 ° C aufbewahrt. Darüber hinaus wurden Urin- und Blutproben für die Urin- und Blutkalziumanalyse gesammelt.

Der Blasenstein wurde in der 2. und 4. Woche per Ultraschall entdeckt. Und die warme, sterile Kochsalzlösung wurde in die Blase injiziert, bis die maximale Ausdehnung erreicht war. Die Ultraschalluntersuchung wurde mit einem Ultraschallsystem (Philips, Best, Niederlande) durchgeführt. Die Proben wurden gesammelt, gemahlen und mit einem erweiterten Steinanalysesystem (Lanmode LIR-20) mit einem Wellenlängenbereich von 500–4000 cm−1 basierend auf der KBr-Pelletpressmethode detektiert.

Für die nicht gezielte Metabolomanalyse wurde ein 1-ml-Aliquot einer Kaninchenurinprobe mit 1 ml Acetonitril/Methanol/Wasser-Lösung (2:2:1, Vol./Vol.) gemischt, mit einem Vortex gemischt, 30 Minuten lang beschallt und bei –20 °C stehengelassen 1 Stunde bei °C zentrifugieren, anschließend eine halbe Stunde bei 4 °C mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Anschließend im Vakuum getrocknet. Für die Massenspektrometrie wurden der getrockneten Probe 100 μl Acetonitril (1:1, Vol./Vol.) zur Auflösung zugesetzt und sie wurde 20 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert.

Die nicht zielgerichteten Metabolomikdaten wurden unter Verwendung eines mit einem Ultrahocheigenschaften-Flüssigkeitschromatographiesystem (UHPLC; Infinity LC; CA, USA) abgestimmten Massenspektrometers (TOF 6600; AB Sciex, Concord, Kanada) abgeleitet. Die Urinmetaboliten wurden unter optimierten Bedingungen bei 4 °C mit einer Dosis von 2 μl abgetrennt. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min, das chromatographische Trennprogramm: 0–1 min, 85 % B; 1–12 Min., 85–65 % B; 12–12,1 Min., 65–40 % B; 12,1–15 Min., 40 % B; 15–15,1 Min., 40–85 % B; 15,1–20 Min., 8 % B (A, 25 mM Ammoniumacetat und Ammoniumhydroxid in Wasser; B, Acetonitril). Bei der UHPLC-MS-Analyse beträgt die Kontrolltemperatur 4 °C. Während der massenspektrometrischen Analyse wurde die ESI-Quelle ausgewählt und verschiedene Detektionsmodi bei einer Quellentemperatur von 600 °C durchgeführt.

Nachdem die Originaldaten ermittelt wurden, werden sie mit dem ProteoWizard-Tool konvertiert, um Daten im zu erhalten. mzML-Format. Dann wird das XCMS verwendet, um Peak-Ausrichtungs- und -Korrekturoperationen durchzuführen, und die Informationen bezüglich der Peakfläche werden extrahiert. Entfernen Sie für XCMS-Extrakt den entsprechenden Ionenpeak, wenn festgestellt wird, dass der fehlende Wert >50 % beträgt. Bei der Mustererkennung wird die Software SIMCA-P 14.1 eingesetzt und die Pareto-Skalierungsmethode zur Vorverarbeitung der Daten verwendet. Anschließend wird eine statistische Analyse durchgeführt, die hauptsächlich PCA- und PLS-DA-Analysen umfasst. Die PLS-DA-Methode wird hauptsächlich zur Bestimmung der R2- und Q2-Qualität sowie der Variablenbedeutung (VIP) verwendet. VIP beschreibt hauptsächlich die Veränderungen pathologischer Reizreaktionen, die durch bestimmte Metaboliten erklärt werden. Bei der Beurteilung des Metaboliten mit signifikantem Unterschied wurden die festgelegten Beurteilungskriterien auf VIP > 1 und P < 0,05 festgelegt. Differenziell exprimierte Metaboliten wurden normalisiert, um Cluster mit ähnlichen Expressionsmustern zu erhalten. Die Wärmekarte wurde durch Clustering unterschiedlich exprimierter Metaboliten basierend auf R-Software abgeleitet. Die KEGG-Analyse wurde mit einem hypergeometrischen Test durchgeführt, wobei die Pfade mit P < 0,05 als signifikant angesehen wurden.

CaCl2 und Na2C2O4 wurden jeweils in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung von 10 mM zu bilden. Die Massenkristallisation des 10-ml-Reaktionssystems wurde in sauberen Glasfläschchen durchgeführt. Zuerst wurde 150 mM wässrige NaCl-Lösung in das Fläschchen gegeben, dann wurden 0,7 ml CaCl2-Lösung unter gleichmäßigem Mischen hinzugefügt. Anschließend wurden die Glasfläschchen 1 Stunde lang bei 60 °C in den Inkubator gestellt, bevor 0,7 ml Na2C2O4-Stammlösung zugegeben wurden. Kristallinhibitoren, z. B. Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure und Gentisinsäure, wurden vor der Na2C2O4-Zugabe in einer geeigneten Menge in das Reaktionssystem gegeben und die endgültige Lösung enthält 1,5 mM Kristallinhibitor. Um die Kristalle zu sammeln, wurden saubere Glasobjektträger auf den Boden des Fläschchens gelegt. Nach dreitägiger Inkubation bei 60 °C wurden die Objektträger entnommen und zur anschließenden Charakterisierung gewaschen und bei 25 °C getrocknet.

Die Morphologie und Dichte der Kristalle wurden zunächst mit einem optischen Mikroskop (Ti2-U, Nikon, Japan) analysiert. Die Fläche und Anzahl der Kristalle in mindestens fünf Feldern wurden mit der Image J-Software geschätzt. Darüber hinaus wurde das Verhältnis zwischen COM und Calciumoxalat-Dihydrat (CSB) durch Zählen aller Kristalle analysiert. Die Morphologie der Kristalle auf dem Glasobjektträger wurde nach der Goldsputternbehandlung durch SEM (EVO, ZEISS, Deutschland) weiter untersucht. Insbesondere wurden zwei verschiedene Arten von Calciumoxalat, nämlich COM und CSB, beobachtet und fotografiert. Um die Wirkung verschiedener Kristallinhibitoren auf die CaOx-Kristallisation weiter zu bewerten, wurde Rasterkraftmikroskopie (AFM, Asylum Research, USA) durchgeführt, um topografische Bilder der Kristalloberfläche (001) zu untersuchen, insbesondere das Ätzphänomen. Die Bilder wurden mit den Spitzen mit einer Federkonstante von 60 N/m im Klopfmodus aufgenommen (Scanbereich: 2 μm; Scanrate: 0,5 Hz).

Die Struktur der Kristalle wurde mit XPS (Kratos, UK) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR, INVENIO R, Schweiz) validiert. Das FTIR-Spektrum verschiedener COM-Kristalle wurde mit einem Wellenlängenbereich von 1000–4000 cm−1 gemessen. Was XPS betrifft, wurden die C 1s-, N 1s- und O 1s-Spektren verschiedener COM-Kristalle, Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure und Gentisinsäure mit der CasaXPS-Software angepasst.

Die Dichtefunktionaltheorie (DFT) wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Kristallinhibitoren und der CaC2O4-Oberfläche theoretisch zu untersuchen.42 Das Funktional der verallgemeinerten Gradientennäherung (GGA) wurde angewendet. Bei der Probenahme in der Brillouin-Zone wurde die Monkhorst-Pack-Methode angewendet. Der Konvergenzstandard der Energie betrug 10−5 eV/Atom.

Die Bindungsenergien der Kristallinhibitormoleküle, einschließlich Bernsteinsäure, Taurin, Salicylursäure, Suberinsäure und Gentisinsäure, auf den CaC2O4-Oberflächen wurden berechnet. Die CaC2O4 (100)- und (021)-Oberflächen wurden durch die 2 × 2- bzw. 2 × 1-Superzellen aufgebaut. Um Wechselwirkungen zu verhindern, wurde ein Vakuumraum von 15 Å angelegt. Die DFT-D2-Methode wurde angewendet, um die vdW-Wechselwirkungen zwischen den Kristallinhibitormolekülen und der CaC2O4-Oberfläche zu berechnen. Während die Formel der Bindungsenergien (Eb) wie folgt lautete:

wobei \(E_{\left( {\rm{Molekül}} - {\rm{CaC}}_{2}{\rm{O}}_4\right)}\) und \(E_{{\rm {CaC}}_2{\rm{O}}_4}\) beziehen sich auf die DFT-Energien der moleküladsorbierten CaC2O4-Oberfläche bzw. der sauberen CaC2O4-Oberfläche.

In dieser Studie wurden die gefrorenen und entspannten Strukturen der CaC2O4-Oberfläche mit oder ohne Anwesenheit von Adsorbaten (Wachstumshemmern) geometrisch verglichen, wie aus unserer früheren Arbeit entnommen. Zur Quantifizierung der Verschiebung entspannter Atome auf der Oberfläche des CaC2O4-Kristalls wurde eine Abstandsmetrik verwendet. Die durchschnittliche Verschiebung δ kann nach folgender Formel berechnet werden:

Dabei beziehen sich N-Atome auf die Anzahl der entspannten Atome auf der CaC2O4-Ebenenoberfläche.

Darüber hinaus wurden die durchschnittlichen Verdrängungs- und Bindungsenergien zwischen Ca2+ und den Kristallinhibitormolekülen (z. B. Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure, Gentisinsäure) mit einer ähnlichen Methode ermittelt.

Männliche SD-Ratten, die von der Chengdu Dossy Animals Factory gekauft wurden, wurden in die Blindkontrollgruppe, die Nierenstein-Modellgruppe und die Behandlungsgruppen (Zitronensäure, Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure und Gentisinsäure) eingeteilt, wobei jede Gruppe mindestens enthielt fünf Ratten. Ethylenglykol wurde für die Konstruktion des Nierensteinmodells mit den SD-Ratten verwendet.54 Konkret wurde das Modell durch kontinuierliche Fütterung von Trinkwasser mit 1 % v/v EG über 28 Tage hinweg erstellt, während die Kontrollgruppe nur mit Trinkwasser ernährt wurde. Während der Modellierung wurde die Behandlung mit Zitronensäure, Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure bzw. Gentisinsäure durchgeführt. Die für das Rattennierensteinmodell verwendete Hemmdosis (200 mg/kg) wurde auf der Grundlage der klinisch-therapeutischen Konzentration von Zitronensäure (dem wirksamen Bestandteil von Uralyt-U) berechnet, die für Ratten auf der Grundlage der Körperoberfläche umgerechnet wurde. Anschließend wurden die Ratten 28 Tage lang durch tägliche Sondenernährung mit wässrigen Lösungen von Taurin, Suberinsäure, Succinat, Salicylursäure und Gentisinsäure behandelt. Alle Ratten waren während des gesamten Experiments am Leben. Das Anfangsgewicht jeder Ratte wurde aufgezeichnet und die Menge der Medikamentensonde entsprechend ihrem Tagesgewicht angepasst.

Die Ratten wurden betäubt, in Rückenlage fixiert und das Herz vollständig freigelegt. Mit einem Einweg-Vakuum-Blutentnahmeröhrchen wurden 3 ml Blut aus dem rechten Ventrikel entnommen und die Nieren entnommen. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 25 °C belassen und 15 Minuten lang zentrifugiert. Für biochemische Tests wurde 1 ml Überstand abgesaugt. Die Morphologie der Nieren wurde fotografisch erfasst. Und jede Niere wurde gewogen und aufgezeichnet. Die Nieren wurden dann in 4 %iger Paraformaldehyd-Fixierlösung gelagert oder für die anschließende Analyse eingefroren.

Die Nierenproben wurden zur Paraffineinbettung in 10 %iger Formalinlösung fixiert und zur Färbung in 10 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Kristallbildung wurde anhand der Von-Kossa-Färbung nachgewiesen. Kristallablagerungen wurden mittels optischer Mikrofotografie und der Image J-Software analysiert. Nierenschnitte wurden einer (PAS-Färbung) unterzogen und die tubuläre Verletzung wurde nach der PaIIer-Methode bewertet: tubuläre Dilatation und flache Epithelzellen (1 Punkt); tubulärer Gips (2 Punkte); nekrotische und abgeblätterte Zellen im tubulären Lumen ohne Ablagerungen (1 Punkt). ); Epithelzellpyknose (1 Punkt).55

Für die Immunhistochemie (IHC) wurden die Nierenschnitte in Xylol, Gradienten-Ethanol und anschließend in 3 % H2O2 inkubiert, um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu blockieren. Die Antikörper CD44 (ab189524, Abcam), IL-6 (ab9324, Abcam) und OPN (ab11503, Abcam) wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Schnitt wurde in PBS gespült und mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von 1:200 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und zum Nachweis von konjugiertem HRP DAB ausgesetzt. Und die Bilder wurden mit dem Image J-Tool ausgewertet.

Vier Wochen nach der Operation wurden Rattennieren aus der Kontrollgruppe, der Modellierungsgruppe und der Bernsteinsäuregruppe (n = 3) entnommen. Bei der Extraktion der Gesamt-RNA wurde das RNeasy-Kit (Qiagen, Deutschland) verwendet, um die erhaltene RNA bei extrem niedrigen Temperaturen aufzubewahren. Gemäß den entsprechenden Anweisungen wurde TruSeq über das entsprechende RNA-Kit (Illumina, USA) synthetisiert. In diesem Syntheseexperiment wurde zunächst die Poly A enthaltende mRNA durch Magnetkügelchen gereinigt. Anschließend wurde die mRNA auf der Grundlage des entsprechenden Kit-Schemas zufällig fragmentiert, um doppelsträngige cDNA zu erhalten. Anschließend wurden die Endreparatur und die dA-Tail-Behandlung durchgeführt, um die nachfolgenden Operationen zu unterstützen. Das Produkt wurde durch PCR gereinigt und angereichert, um die erforderliche cDNA-Bibliothek zu erhalten. Qubit wird für die quantitative Analyse der gereinigten Bibliothek verwendet. Zur Überprüfung der Bibliothek wurden ein Fluorometer® 2.0 (Life Tech, USA) und ein Analysator 2100 (Agilent, USA) verwendet. Anschließend wird die molare Konzentration berechnet und analysiert. Nach Verdünnung der gereinigten Bibliothek wurden Cluster von cBot generiert und getestet. Im Sequenzierungsprozess wurde NovaSeq 6000 (Illumina, USA) verwendet.

Verwenden Sie Hisat2, um die gepaarte Terminalsequenzdatei (fastq) dem Ensembl-Referenzgenom zuzuordnen, und konvertieren Sie dann die ausgegebene SAM-Datei, um die BAM-Datei zu erhalten. Während der Sortierung wird SAMtools 1.3.1 angewendet, um die zugeordneten Messwerte in die BAM-Datei umzuwandeln, die Unterstützung für die anschließende FPKM-Analyse bietet. Die Gene wurden mit dem StringTie1.33b-Tool analysiert. Die differentielle Expressionsanalyse (DEGs) für mRNA wurde basierend auf R-Paket-EdgeR durchgeführt, und Gene mit einer Faltungsänderung von über 1,5 und P <0,05 wurden als DEGs betrachtet. Das Vulkandiagramm wurde mit dem Softwarepaket EnhancedVolcano gezeichnet. Die standardisierte Genexpression von FPKM wurde durch Verarbeitung mit Clustering-Tools im R-Paket erhalten und auf dieser Grundlage wurden die Gencluster mit ähnlicher Expression bestimmt. In der Heatmap werden die Genexpressionsdaten durch die Formel y = (x-α)/λ normalisiert, wobei sich x auf die tatsächliche Expression bezieht und λ der Varianz der Proben entspricht. Das Online-Tool Metascape wird für die GO-Anreicherungsanalyse verwendet. Der Datensatz von DEG wurde mittels RNA-Sequenz analysiert und seine Verteilung bestimmt. Wenn P <0,05 ist, gilt der Signalweg als signifikant

Die Gesamt-RNA wurde mit TRzol-Reagenz aus den Nierenproben isoliert und die cDNA wurde durch reverse Transkription auf Basis des PrimeScript™-Kits (Takara, Japan) hergestellt. Q-PCR wurde auf einem Lightcycler 96-System (Roche, Schweiz) durchgeführt, um die Genexpression auf mRNA-Ebene nachzuweisen. Die Grundierungen sind im Anhang der Ergänzungstabelle 6 zu sehen. Das Temperaturzyklusprogramm: 95 °C für 30 s; 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s. Das relative Ausmaß der Genexpression durch Q-PCR wurde mit einer 2−ΔΔCt-Methode berechnet.

Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Statistische Unterschiede wurden mit einem unabhängigen t-Test oder einer einseitigen Varianzanalyse mit dem Tukey-Test unter Verwendung von SPSS 11.0 überprüft. Der signifikante Schwellenwert wurde auf 0,05 festgelegt.

Alle Daten dieser Forschung wurden im Papier und/oder in den Zusatzinformationen präsentiert. Die RNA-seq-Rohdaten wurden in der SRA-Datenbank mit dem Zugangscode PRJNA874063 hinterlegt und die ursprünglichen, nicht zielgerichteten metabolomischen Daten wurden in MetaboLights mit der Zugangsnummer MTBLS5921 hinterlegt.

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Diese Studie wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 32171351), dem „1.3.5“ Project for Disciplines of Excellence, dem West China Hospital, der Sichuan University (Grant-Nr. ZYJC18002) und Med-X Innovation gesponsert Programm des Med-X Center for Materials, Sichuan University (Grant No. MCM202104), das von der China Postdoctoral Science Foundation (2022M722277) finanzierte Projekt und der Postdoctoral Interdisciplinary Innovation Fund der Sichuan University. Wir danken Frau Lei Wu und Bo Su von der Histology and Imaging Platform, Core Facilities of West China, Sichuan University, Herrn Yun-fei Tian und Shu-guang Yan vom Analytical & Testing Center der Sichuan University, Sichuan University, und Frau . Nian-guo Zhu vom Institute of Respiratory Health, West China Hospital, Sichuan University für die technischen Unterstützungen. Wir danken Xi-jing Yang und Xiao-ting Chen vom Tierversuchszentrum des West China Hospital für ihre Unterstützung bei Tierversuchen.

Labor für Stammzell- und Gewebetechnik, Orthopädisches Forschungsinstitut, Abteilung für Orthopädie, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Xiu-zhen Zhang, Xiong-xin Lei, Yan-lin Jiang, Long-mei Zhao, Chen-yu Zou, Ya-xing Li, Rui Wang, Qian-jin Li, Qiu-zhu Chen, Ming-hui Fan, Yu- ting Song, Wen-qian Zhang, Jesse Li-Ling & Hui-qi Xie

Abteilung für Urologie, Institut für Urologie, West China Hospital, Sichuan-Universität, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Yun-jin Bai

Forschungskerneinrichtung des West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Yi Zhang

Abteilung für medizinische Genetik, West China Second University Hospital, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Jesse Li-Ling

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XZZ, HQX und JLL konzipierten die Idee und bereiteten das Manuskript vor. XZZ, XXL und CYZ erstellten ein Rattennierensteinmodell und eine Analyse. XZZ, YLJ und YJB erstellten ein Modell und eine Analyse für Kaninchenblasensteine. XZZ, LMZ, CYZ, RW, QJL und QZC führten eine COM-Kristallisierung und -Analyse durch. XZZ, XXL, CYZ, LMZ, RW und QJL waren die Hauptautoren, mit Beiträgen aller Autoren. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu. XZZ, LMZ und XXL führten eine nicht gezielte Metabolomics-Verarbeitung und RNA-seq-Daten durch.

Korrespondenz mit Hui-qi Xie.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Xz., Lei, Xx., Jiang, Yl. et al. Anwendung der Metabolomik bei Urolithiasis: Entdeckung und Verwendung von Succinat. Sig Transduct Target Ther 8, 41 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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Eingegangen: 09. September 2022

Überarbeitet: 04. Januar 2023

Angenommen: 10. Januar 2023

Veröffentlicht: 21. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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Menschliche Zelle (2023)