Kristallstrukturen offenbaren katalytische und regulatorische Mechanismen des Dualen

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4880 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das E1-Enzym Uba6 initiiert die Signalübertragung, indem es Ubiquitin und das Ubiquitin-ähnliche Protein FAT10 in einem zweistufigen Prozess aktiviert, der eine sequentielle Katalyse der Adenylierung und der Bildung von Thioesterbindungen umfasst. Um mechanistische Einblicke in diese Prozesse zu gewinnen, haben wir die Kristallstruktur eines menschlichen Uba6/Ubiquitin-Komplexes bestimmt. Es werden zwei unterschiedliche Architekturen des Komplexes beobachtet: eine, in der Uba6 eine offene Konformation annimmt, wobei das aktive Zentrum für die Katalyse der Adenylierung konfiguriert ist, und eine zweite, drastisch unterschiedliche geschlossene Konformation, in der das aktive Zentrum der Adenylierung zerlegt und für die Katalyse der Bildung von Thioesterbindungen neu konfiguriert wird . Überraschenderweise bindet ein Inositolhexakisphosphat (InsP6)-Molekül an eine bisher nicht identifizierte allosterische Stelle auf Uba6. Unsere strukturellen, biochemischen und biophysikalischen Daten zeigen, dass InsP6 die Uba6-Aktivität allosterisch hemmt, indem es die gegenseitige Umwandlung der offenen und geschlossenen Konformationen von Uba6 verändert und gleichzeitig seine Stabilität erhöht. Unsere Strukturen enthüllen nicht nur die molekularen Mechanismen der Katalyse durch Uba6 und die allosterische Regulierung seiner Aktivitäten, sondern bieten auch einen Rahmen für die Entwicklung von Uba6-spezifischen Inhibitoren und erhöhen die Möglichkeit einer allosterischen Regulierung anderer E1s durch natürlich vorkommende zelluläre Metaboliten.

Die posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen durch Ubiquitin (Ub) und Ub-ähnliche Proteine ​​(Ubls) unterstützt die Regulierung grundlegender zellulärer Prozesse, einschließlich der Kontrolle des Zellzyklus, der DNA-Reparatur, der Signaltransduktion und der Immunität1. Die Ub/Ubl-Konjugation erfordert die aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen und Aktivitäten paralleler Kaskaden von Enzymen, bestehend aus E1, E2 und am häufigsten E3, die gemeinsam Ub/Ubl aktivieren, transportieren und an Zielproteine ​​binden2. Die beiden menschlichen Ub-E1s, Uba1 und Uba6, fungieren als Torwächter der Ub-Konjugationskaskade, indem sie die ATP-Hydrolyse (Adenylierung) mit der Bildung einer hochenergetischen E1-Ub-Thioesterbindung (Thiolierung) koppeln. Anschließend erfolgt die Übertragung von aktiviertem Ub auf bestimmte Repertoires verwandter E2-Enzyme (Transthioesterifizierung)3,4,5,6,7,8,9. Während Uba1 spezifisch für die Ub-Aktivierung ist, zeigt Uba6 eine doppelte Spezifität für Ub und FAT10 5,8, wobei letzteres ein Ubl ist, das an der mitotischen Progression10 und Immunität11,12,13,14 beteiligt ist und an Krebs beteiligt ist15,16,17,18,19 ,20,21.

Während sich Uba6 bisher einer strukturellen Charakterisierung entziehen konnte, haben zahlreiche Studien gezeigt, dass Uba1 ein großes Multidomänenenzym ist, in dem jede Domäne eine bestimmte funktionelle Rolle bei der Katalyse der Ub-Adenylierung22,23 und der Bildung von E1-Ub-Thioesterbindungen24,25,26 spielt. und E1-E2-Ub-Transthioesterifizierung27,28,29,30. Aktive und inaktive Adenylierungsdomänen (AAD bzw. IAD) sind für die anfängliche Rekrutierung von Ub verantwortlich und beherbergen auch die katalytische Maschinerie für die Adenylierung des C-Terminus von Ub im ersten Schritt der Ub-Aktivierung. Die E1-Cys-Domäne ist in zwei kugelförmigen Halbdomänen angeordnet, die als erste und zweite katalytische Cystein-Halbdomänen (FCCH bzw. SCCH) bezeichnet werden. Die FCCH-Domäne spielt eine Rolle bei der Ub-Erkennung und die SCCH-Domäne beherbergt den katalytischen Cysteinrest, der an der Bildung der Ub-Thioesterbindung im zweiten Schritt der Ub-Aktivierung beteiligt ist. Jüngste Studien haben gezeigt, dass E1 große Konformationsänderungen durchlaufen, die für die Adenylierung und Bildung von Thioesterbindungen erforderlich sind24,25,31,32. Studien an Uba125 sowie an E1 für das Ubl-SUMO haben gezeigt, dass die Adenylierung mit E1 in einer „offenen“ Konformation erfolgt und dass die Bildung der Thioesterbindung eine Drehung (oder „Schließung“) der SCCH-Domäne um etwa 130° beinhaltet transportiert das katalytische Cystein in das aktive Zentrum31. Schließlich ist die Ubiquitin-Fold-Domäne (UFD) an der molekularen Erkennung von E2 und der anschließenden Übertragung von Ub vom katalytischen Cystein E1 auf E2 beteiligt26,27,28,29,30. Basierend auf der Sequenzanalyse5 wird vorausgesagt, dass Uba6 eine ähnliche Domänenorganisation wie Uba1 aufweist. Da jedoch keine Strukturdaten vorliegen, sind die molekularen Mechanismen, durch die Uba6 Ub und FAT10 aktiviert, unbekannt. Während außerdem fast das gesamte Uba1 in proliferierenden Säugetierzellen im aktivierten Uba1~Ub-Zustand vorliegt, ist Uba6 unter ähnlichen Bedingungen nur zu 50 % aktiviert6,33. Die molekulare Grundlage für diesen Unterschied muss noch ermittelt werden.

Angesichts der entscheidenden Rolle, die die Ub-Konjugation bei der Regulierung unzähliger zellulärer Prozesse beim Menschen spielt, ist es vielleicht nicht überraschend, dass die für die Ub-Konjugation verantwortliche enzymatische Maschinerie selbst mehreren Ebenen von Regulierungsmechanismen unterliegt, die eine Feinabstimmung und Modulation ihrer Funktion ermöglichen34 ,35. E1-, E2- und E3-Enzyme, die in mehreren Ub/Ubl-Wegen funktionieren, sowie die Ub/Ubls-Substrate selbst werden durch PTMs reguliert, wie z. B. Phosphorylierung, Acetylierung, Desamidierung, ADP-Ribosylierung, Ubiquitinierung, SUMOylierung und NEDDylierung34,35. Zusätzlich zu PTMs sind mehrere natürlich vorkommende kleine Moleküle bekannt, die die Ub/Ubl-Signalwege regulieren. Beispielsweise werden Mitglieder der größten Familie der E3-Ub-Ligasen, die Cullin-RING-E3-Ub-Ligasen (CRLs), durch Inositolhexakisphosphat (InsP6) und andere Inositphosphate negativ reguliert36,37,38,39. Insbesondere werden CRLs durch COP9-Signalosom-vermittelte Deneddylierung deaktiviert und InsP6 dient als Cofaktor, der die CRL/COP9-Wechselwirkung fördert38,39. Es wurde auch gezeigt, dass InsP6 und InsP5 direkt mit den Substratadapter-Untereinheiten der pflanzlichen CRLs SCFTIR1 und SCFCOI1 interagieren und eine strukturelle Rolle bei der Unterstützung der Funktion von TIR1 und COI1 als Auxin- bzw. Jasmonatrezeptoren spielen36,37. Angesichts des stetigen Entdeckungstempos von PTM und durch kleine Moleküle vermittelten Regulierungsmechanismen der Ub-Signalisierung und der relativ geringen Anzahl an Studien, die sich auf Uba6 konzentrieren, bleiben die Mechanismen, die die Aktivität von Uba6 steuern, unbekannt.

Um Einblicke in die molekulare Basis zu gewinnen, auf der Uba6 die Aktivierung von Ub/FAT10 katalysiert, haben wir die 2,25 Å-Kristallstruktur eines menschlichen Uba6/Ub-Komplexes bestimmt. Der Uba6/Ub-Komplex wird in zwei drastisch unterschiedlichen Konformationen beobachtet: einer offenen Konformation, die für die Adenylierung bereit ist, und einem geschlossenen Komplex, der für die Bildung von Thioesterbindungen bereit ist. Darüber hinaus beobachteten wir ein Inositolhexakisphosphat (InsP6)-Molekül, das an eine evolutionär konservierte, hochbasische Tasche gebunden ist, die nur in der Uba6-SCCH-Domäne vorkommt. Kontakte mit InsP6 in der offenen Konformation umfassen mehrere Reste und Strukturelemente, die während der Bildung der Thioesterbindung eine Umlagerung erfahren, sowie Reste, die für die Katalyse wichtig sind. Wir stellen außerdem fest, dass InsP6 die Uba6-Aktivität allosterisch hemmt, indem es die gegenseitige Umwandlung der offenen und geschlossenen Konformationen von Uba6 verändert und gleichzeitig seine Stabilität erhöht. Insgesamt enthüllen unsere Studien die strukturellen Grundlagen für die katalytischen Aktivitäten von Uba6 und enthüllen unerwartet einen einzigartigen Mechanismus der allosterischen Regulation durch einen natürlich vorkommenden zellulären Metaboliten, der spezifische mechanistische Merkmale von Uba6 nutzt.

Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, durch die Uba6 Ub/FAT10 aktiviert, wollten wir die Kristallstruktur eines menschlichen Uba6/Ub-Komplexes bestimmen. In unseren Strukturstudien wurde eine katalytische Cystein-zu-Alanin-Mutante von menschlichem Uba6 (C625A) verwendet, die die Adenylierung, jedoch nicht die Bildung von Thioesterbindungen (Thiolierung) katalysieren kann (Abb. 1a), um die Probenheterogenität zu verringern und die Kristallisation zu erleichtern. In unseren Strukturstudien wurde aus Insektenzellen stammendes rekombinantes menschliches Uba6C625A verwendet, da die Proteinausbeuten im Vergleich zur Expression in Bakterien deutlich höher waren. Vor der Durchführung von Kristallisationsversuchen wurde menschliches Uba6C625A mit Ub und ATP·Mg2+ gemischt, um die Adenylierung zu fördern, und es wurden Kristalle in Beugungsqualität erhalten, die zwei Komplexe in der asymmetrischen Einheit (AU) enthielten. Nach umfangreichem Screening und Verfeinerung wurde eine Struktur des menschlichen Uba6C625A/Ub-Komplexes mit einer Auflösung von 2,25 Å mit R/Rfree-Werten von 0,166/0,206 und ausgezeichneter Geometrie bestimmt (Ergänzungstabelle 1). Ub aus beiden Kopien des menschlichen Uba6C625A/Ub-Komplexes in der AU zeigte eine starke und kontinuierliche Elektronendichte an ihren C-Termini, was mit dem Ub-Adenylat-Produkt übereinstimmt. Im Gegensatz dazu fehlte die Elektronendichte, die der Pyrophosphat (PPi)-Abgangsgruppe und Mg2+ entsprach (ergänzende Abbildung 1a). Somit stellen die Komplexe den Produktkomplex der Adenylierung nach der Freisetzung von PPI und Mg2+ dar.

a Schematische Darstellung der Uba6~Ub-Thioesterbildungsreaktion. b Cartoon-Darstellung der Kristallstruktur von Uba6/Ub-AMP/InsP6 in der offenen E1-Konformation. Die IAD-Domäne befindet sich in Slate; AAD ist in Pink; FCCH ist in Hotpink; SCCH ist in Magenta; UFD ist in Orange; Cys-Kappe ist in Cyan; und Ub(a) ist in Gold. Das katalytische Cystein wird durch eine gelbe Kugel angezeigt. AMP und InsP6 sind durch Kugeln gekennzeichnet. c Cartoon-Darstellung der Kristallstruktur von hUba6/Ub-AMP in der geschlossenen E1-Konformation, dargestellt wie in b. Schematische Darstellungen der Domänenorganisation von Uba6 mit ungeordneten Regionen, die durch schraffierte Kästchen gekennzeichnet sind, sind unten in b und c dargestellt.

Bemerkenswerterweise weisen die beiden Kopien des menschlichen Uba6C625A/Ub-Adenylat-Komplexes im kristallographischen AU im Verhältnis zueinander drastisch unterschiedliche Architekturen auf (Abb. 1b, c). In einer Kopie ist das aktive Adenylierungszentrum vollständig geordnet und die SCCH-Domäne nimmt eine „offene“ Konformation an, wobei das katalytische Cystein (C625A) mehr als 35 Å von der Glycylphosphatbindung von Ub-AMP entfernt ist, das während der Thioesterbindung nukleophil angegriffen wird Bildung (Abb. 1b). Wir bezeichnen diese Adenylierungs-kompetente Konformation des menschlichen Uba6C625A/Ub-Adenylat-Komplexes im Folgenden als Uba6OPEN/Ub-AMP. In der anderen Kopie des Komplexes in der AU ist das aktive Adenylierungszentrum teilweise zerlegt und die SCCH-Domäne nimmt eine „geschlossene“ Konformation an, die eine Drehung des starren Körpers um 136° aufweist (relativ zu Uba6OPEN/Ub-AMP). Dadurch wird der β-Kohlenstoff des katalytischen Cysteins (C625A) etwa 4 Å von der Glycylphosphatbindung von Ub-AMP entfernt platziert und zusätzliche Strukturelemente, die für die Bildung der Thioesterbindung wichtig sind, in das aktive Zentrum gebracht (Abb. 1c). Wir bezeichnen diese thiolierungsfähige Konformation des Komplexes im Folgenden als Uba6CLOSED/Ub-AMP. Ein weiterer Vergleich zeigt, dass das UFD der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur im Vergleich zur Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur eine Drehung des starren Körpers um 22° in Richtung der SCCH-Domäne erfährt (Abb. 1b, c). Diese strukturellen Veränderungen führen dazu, dass die Länge des Canyons zwischen der UFD- und der SCCH-Domäne von ~35 Å in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur auf ~24 Å in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur abnimmt (Abb. 1c). Eine weitere Überraschung in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur war das Vorhandensein einer starken Elektronendichte, die einem Inositolhexakisphosphat (InsP6)-Molekül entspricht, das sich in der SCCH-Domäne befindet (Abb. 1b). Schließlich wird eine geordnete Schleifenregion innerhalb der SCCH-Domäne, die das katalytische Cystein in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur verschließt (als „Cys-Cap“ bezeichnet), in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ungeordnet. Wie die beobachteten Konformationsänderungen und die Bindung durch InsP6 mechanistisch und funktionell mit der Uba6-Aktivität zusammenhängen, wird unten diskutiert.

Insgesamt ähnelt die Uba6/Ub-Interaktion der von Uba1/Ub22,23 und um Einblicke in die duale Spezifität von Uba6 für Ub und FAT10 zu gewinnen, haben wir ein Uba6/FAT10-Modell erstellt, indem wir FAT10 (PDB: 6GF2)40 an Ub andockten aus der Uba6/Ub-Struktur (Ergänzende Abbildung 1d, e). Das Uba6/FAT10-Modell und die Sequenzanalyse zeigen, dass FAT10 an Ub-Positionen, die mit Uba6 interagieren, nur 31 % Identität aufweist (ergänzende Abbildung 1f). Unter den vielen Divergenzbereichen zwischen Ub und FAT10 befindet sich der hydrophobe Ile44-Patch von Ub (Leu8/Ile44/Val70), der bekanntermaßen für die Uba1-Aktivierung von Ub41 von entscheidender Bedeutung ist und an einem ähnlichen Netzwerk hydrophober Wechselwirkungen im Uba6/Ub beteiligt ist Struktur ist in FAT10 nicht konserviert (ergänzende Abbildung 1d – f). In FAT10 ist die dem Ub-Ile44-Patch entsprechende Region viel polarer geworden und umfasst Ser95, Thr132 und Ala159. Daher ist das gleiche Netzwerk funktionell wichtiger hydrophober Kontakte, an dem Ub mit Uba1 und Uba6 beteiligt ist, für FAT10 nicht möglich. Zusätzlich zu den Unterschieden bei vielen anderen Ub-Resten, die mit Uba6 in der Uba6/Ub-Struktur interagieren, weist FAT10 eine Insertion aus zwei Resten in der β1-β2-Schleife auf, die sich in der Nähe des AAD von Uba6 befindet, wo es an einzigartigen Wechselwirkungen teilnehmen kann ( Ergänzende Abbildung 1d–f) und ein einzigartiges „CYCI“-Motiv am C-Terminus, das eine Rolle bei der Spezifität spielt42. Schließlich unterscheidet sich FAT10 von Ub dadurch, dass es zwei Tandem-Ub-ähnliche Domänen (NTD und CTD) enthält, die durch eine Linkerregion verbunden sind (ergänzende Abbildung 1e), von der frühere Studien gezeigt haben, dass sie für die Aktivierung von FAT10 durch Uba640 von entscheidender Bedeutung ist, obwohl sie recht weit entfernt liegt von der Oberfläche des Enzyms. Wie genau sich die oben genannten Unterschiede im FAT10-CTD auf dessen Bindungsart an Uba6 auswirken, welche Rolle der NTD-CTD-Linker und möglicherweise das NTD selbst bei der Uba6-Bindung spielen könnten und ob diese Unterschiede das Fehlen des hydrophoben Ile44-Patches kompensieren könnten in FAT10 wartet auf die Bestimmung einer Uba6/FAT10-Struktur.

Die SCCH-Domäne ist über zwei flexible Schleifen an die Adenylierungsdomänen von Uba6 gebunden. Diese werden als Crossover-Loop bezeichnet, der das katalytische Cystein beherbergt und zum Anfang der SCCH-Domäne führt, und als Reentry-Loop, der die SCCH-Domäne wieder mit den Adenylierungsdomänen verbindet (Abb. 2a). Wie oben erwähnt, erfährt die SCCH-Domäne eine 136°-Rotation (auch als Domänenalternation bezeichnet), die das katalytische Cystein in das aktive Zentrum der Adenylierung überführt. Der SCCH-Domänenwechsel geht mit einer Biegung der Crossover-Schleife zwischen den Resten Arg615 und Pro623 und einer orthogonalen Biegung der Wiedereintrittsschleife zwischen den Resten Gly888 und Ala893 einher (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2b). In der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur befindet sich das katalytische Cystein auf einer kurzen Helix (H18) innerhalb der Crossover-Schleife, während in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur H18 zu einer verlängerten Schleife verschmilzt. Dadurch wird das katalytische Cystein für den nukleophilen Angriff der Glycylphosphatbindung von Ub-AMP ausgerichtet (Abb. 2a und ergänzende Abb. 1b). Der veränderte Weg der Crossover-Schleife, die das katalytische Cystein für die Thiolierung positioniert, wird durch die Bildung eines kurzen β-Strangpaares (β23–β24) in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur stabilisiert, während dies bei den Resten, die β23–β24 umfassen, der Fall ist flexible Schleifen in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur (Abb. 2a).

ein Vergleich der Uba6-SCCH-Domäne in der offenen (Adenylierung aktiv) und geschlossenen (Thioesterbindungsbildung aktiv) Konformation. Die Adenylierungsdomänen (die als starrer Körper von Uba6 dienen) wurden überlagert und die SCCH-Domänen sind als Cartoons dargestellt, während die katalytischen Cysteine ​​als Kugeln dargestellt sind. Der Rotationsgrad zwischen jedem Konformationszustand der SCCH-Domäne ist angegeben. Um einen Referenzrahmen bereitzustellen, wird die relative Position des katalytischen Cysteins in den anderen Konformationszuständen der SCCH-Domäne durch halbtransparente gelbe Kreise angezeigt und in jedem der Felder entsprechend beschriftet. Ausgewählte Helices der SCCH-Domäne sind markiert und ihre N- und C-Termini sind mit „nt“ bzw. „ct“ gekennzeichnet. b, c Elemente in den Strukturen Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, links, Mitte) und Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, links, Mitte), die beim Übergang vom Adenylierungs- in den Thiolierungs-kompetenten Zustand Konformationsänderungen erfahren werden als farbcodierte und beschriftete Cartoons dargestellt, während der Rest des Komplexes als Oberflächendarstellung dargestellt wird. Übersicht über die aktiven Zentren Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, rechts) und Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, rechts) mit Resten, die mit dem Adenylat-Zwischenprodukt in Kontakt stehen, dargestellt als Stäbchen. Wasserstoffbrückenbindungen werden als gestrichelte Linien und ausgewählte Wassermoleküle als rote Kugeln dargestellt.

Zusätzlich zu Konformationsänderungen innerhalb der Crossover- und Wiedereintrittsschleifen von Uba6, die mit dem SCCH-Domänenwechsel einhergehen, geht die Cys-Kappe von Uba6 (Reste 798–817) von einem geordneten Zustand in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur in einen ungeordneten Zustand in der Uba6CLOSED-Struktur über /Ub-AMP-Struktur (Abb. 2a). In der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur verbirgt die Cys-Kappe das katalytische Uba6-Cystein (Abb. 2a, b), was es vor oxidativen oder chemischen Schäden schützen kann, die die Aktivität verringern würden. In der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur bringt der SCCH-Domänenwechsel die Cys-Kappe in unmittelbare Nähe der katalytischen Maschinerie für die Adenylierung (Abb. 2c und ergänzende Abb. 1c). Wenn die Cys-Kappe die gleiche Konformation wie in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur annehmen würde, würde es zu schweren sterischen Konflikten kommen. Somit dient die Fehlordnung der Cys-Kappe während der Thiolierung zwei Zwecken: Erstens erhöht sie die Lösungsmittelzugänglichkeit des katalytischen Cysteins und erhöht dadurch seine Reaktivität, und zweitens erleichtert sie den SCCH-Domänenwechsel, indem sie sterische Konflikte mit der Adenylierungsdomäne in der geschlossenen Konformation verhindert .

Wie oben erwähnt, stellt das aktive Zentrum der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur das Ub-Adenylatprodukt der Adenylierungsreaktion nach der Freisetzung der PPi-Abgangsgruppe und Mg2+ dar. In Bezug auf die Glycylphosphatbindung zwischen Ub Gly76 und AMP im Ub-Adenylat ist der Carbonylsauerstoff von Gly76 aus Ub an einem Netzwerk direkter und wasservermittelter Wasserstoffbrückenbindungen mit den Grundstickstoffatomen von Gly469, Ala470, Ile471 und Gly472 beteiligt von Uba6 und das AMP-Phosphat (z. B. das α-Phosphat von ATP) ist an direkten Wasserstoffbrückenbindungen mit Ala470, Arg508 und Gln509 beteiligt (Abb. 2b). Das Andocken von ATP·Mg2+ aus der Struktur von S. pombe Uba1 (PDB: 4II2) in das aktive Zentrum von Uba6, das dem Substratkomplex der Adenylierungsreaktion nahekommt, zeigt, dass Arg46 und Arg508 für die Wechselwirkung mit dem γ-Phosphat von ATP positioniert sind Asp569 ist so positioniert, dass es ein konserviertes Mg2+-Ion koordiniert, und Asp499, Glu502 und Asn505 sind so positioniert, dass es an der Koordination eines zweiten Mg2+-Ions beteiligt ist (ergänzende Abbildung 2a). In der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ist der Carbonylsauerstoff von Ub Gly76 an demselben Netzwerk direkter und wasservermittelter Wasserstoffbrücken beteiligt, wie es in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur beobachtet wird (Abb. 2c). Das AMP-Phosphat ist an einer äquivalenten Wasserstoffbindung zum Grundstickstoff von Uba6 Ala470 beteiligt und hat infolge des Domänenwechsels und der Umgestaltung des aktiven Zentrums eine neue Wasserstoffbindung mit Thr626 aufgebaut, während es den Kontakt zu Arg508 und Gln509 verliert (Abb. 2c). Schließlich findet ein Netzwerk wasservermittelter Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Grundstickstoff von Gly76, den AMP-Phosphat- und Adeningruppen und Uba6 Asp569, Asn570 und Lys628 statt, das einzigartig für die Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ist (Abb. 2c). .

Der Vergleich der adenylierungskompetenten Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur mit der thiolierungskompetenten Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur zeigt ein umfangreiches Netzwerk von Konformationsänderungen innerhalb der Adenylierungsdomäne, die mit dem SCCH-Domänenwechsel gekoppelt sind und gemeinsam zur Umgestaltung des aktiven Zentrums von Uba6 dienen um die Thiolierung zu katalysieren (Abb. 2b, c und ergänzende Abb. 2c). Bemerkenswert ist, dass mehrere wichtige katalytische Reste aus Regionen stammen, die während des Übergangs vom Adenylierungs- zum Thiolierungs-fähigen Zustand umgestaltet werden. Dazu gehören die Aminosäuren 499–599 des AAD (als „g6-Region“ bezeichnet, da sie die kurze 310-Helix, g6, enthält) und die Helix H1 (Reste 46–51) des IAD (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2c). . In der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur interagieren die g6-Region und H1 miteinander, was dabei hilft, die für die Adenylierung wichtigen Reste richtig zu positionieren und als Plattform für die offene Konformation der SCCH-Domäne dient (Abb. 2b). In der thiolierungskompetenten Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur entfaltet sich die g6-Region des AAD und erstreckt sich vom AMP vom Ub-Adenylat weg, wo sie mit der SCCH-Domäne interagiert, um die geschlossene Konformation und die Helices H1 und H2 des zu stabilisieren IAD klappt aus dem aktiven Zentrum heraus, um Kollisionen mit der SCCH-Domäne zu vermeiden (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2d). Dies führt dazu, dass für die Adenylierung wichtige Reste, einschließlich Arg46, Glu502, Asn505, Arg508 und Gln509, aus dem aktiven Zentrum verdrängt und durch Reste ersetzt werden, die für die Bildung von Thioesterbindungen wichtig sind.

In der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ist der β-Kohlenstoff der katalytischen Cysteinmutante C625A 4,5 Å vom Gly76-Carbonylkohlenstoff entfernt und für den für die Thiolierung erforderlichen nukleophilen Angriff bereit (Abb. 2a, c und ergänzende Abb. 2c). Bei der Modellierung als Cystein verringert sich dieser Abstand auf ~4 Å und der γ-Schwefel kann mit nur einer geringfügigen Änderung des Pfads der Crossover-Schleife an der richtigen Position für die Reaktivität platziert werden. Thr626 geht eine Wasserstoffbrücke mit dem Phosphat von AMP ein und Lys628 geht eine Salzbrücke mit Asp569 aus der Adenylierungsdomäne ein (Abb. 2c), von der vorhergesagt wird, dass sie Mg2+ während der Katalyse der Adenylierung koordiniert (ergänzende Abb. 2a). Alle drei dieser Reste (Cys625, Thr626 und Lys628) befinden sich in der Helix H18 in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur, was weiter bestätigt, dass das Schmelzen dieser Helix in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ein wichtiger Aspekt der Umgestaltung des aktiven Zentrums ist ist für die richtige Positionierung dieser Reste für die Thiolierung notwendig.

Insgesamt liefern unsere Strukturen die folgenden Einblicke in die molekularen Mechanismen, durch die Uba6 die Adenylierung und die Bildung von Thioesterbindungen katalysiert. Die Konstellation der Aminosäuren im aktiven Zentrum in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur legt nahe, dass das C-terminale Carboxylat von Ub Gly76 für den nukleophilen Angriff des α-Phosphats von ATP während der Katalyse der Adenylierung durch Wasserstoffbrückenbindung und Ladungskomplementarität über Wechselwirkungen koordiniert ist mit Gly469, Ala470, Ile471, Gly472 am N-terminalen Ende der Uba6-Helix H14. Obwohl ATP in unserer Struktur nicht vorhanden ist, deuten Modellierungen darauf hin, dass die PPi-Abgangsgruppe während der Katalyse der Adenylierung durch die basischen und polaren Reste Arg46, Asn505, Arg508, Gln509 und Lys521 stabilisiert wird (ergänzende Abbildung 2a). Während der Adenylierung stabilisiert Mg2+ wahrscheinlich nicht nur das α-Phosphat, das während des nukleophilen Angriffs invertiert wird, sondern verringert auch die elektrostatische Abstoßung zwischen dem Ub-Gly76-Carboxylat und dem α-Phosphat von ATP. Nach der Freisetzung der PPi-Abgangsgruppe zerlegen der SCCH-Domänenwechsel und die Umgestaltung des aktiven Zentrums die katalytische Maschinerie für die Adenylierung und reorganisieren sie für die Thiolierung. Dies treibt die Reaktion voran und verhindert gleichzeitig die Rückreaktion (z. B. Neubildung von ATP und freiem Ub). In beiden Strukturen zeigen das α-Phosphat und der C-terminale Carbonylsauerstoff von Gly76 von Ub-AMP, die während der Adenylierung bzw. Thiolierung nukleophil angegriffen werden, direkt zum N-terminalen Ende der Helix H14 von Uba6. Dies legt wiederum nahe, dass die Elektropositivität des Helixdipols dazu beitragen könnte, die negative Ladung des Übergangszustands und der tetraedrischen Zwischenprodukte zu stabilisieren, die sowohl während der Adenylierungs- als auch der Thiolierungsreaktion gebildet werden.

Wie oben erwähnt, beobachteten wir in unserer 2,25 Å großen Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur eine starke Elektronendichte in einer tiefen Tasche auf der Oberfläche der SCCH-Domäne in der Nähe von H18 und dem katalytischen Uba6-Cystein (Abb. 3a – e). Basierend auf seiner sechsfachen Symmetrie und der umgebenden chemischen Umgebung identifizierten wir diese Dichte als einem Molekül von InsP6 entsprechend (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3a). Da dieses Molekül weder in Protein- noch in Kristallisationspuffern enthalten war, muss es nach der Expression in Insektenzellen zusammen mit dem Protein gereinigt worden sein. Die Elektronendichte stimmt mit der stabilsten Form von InsP6, myo-InsP6, in der Stuhlkonfiguration überein, wobei das Phosphat an der 2-Position axial und die Phosphate an den 1-, 3-, 4-, 5- und 6-Positionen äquatorial sind. Die Analyse der Struktur zeigt, dass das InsP6-Molekül an eine hochbasische Tasche innerhalb des kugelförmigen Kerns der SCCH-Domäne bindet, die vom Zebrafisch bis zum Menschen nahezu vollständig konserviert ist (beachten Sie, dass Uba6 spezifisch für Wirbeltiere und Seeigel ist) (Abb. 3f). Das axiale Phosphat von InsP6 ist an einem Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen mit Lys644, Lys706, Lys709 und Tyr710 beteiligt, während die äquatorialen Phosphate Ser647, Lys652, Lys687, Arg691 und Lys714 kontaktieren, wobei Trp640 eine strukturelle Rolle bei der Organisation der Bindungstasche spielt ( Abb. 3a, d).

a–c Elektrostatische Oberflächendarstellungen der SCCH-Domänen menschlicher offener (a) Uba6-Strukturen (b), geschlossener Uba6-Strukturen (b) und Uba1-Strukturen (c). Uba6-Reste, die an Kontakten zu InsP6 in der offenen Uba6-Struktur beteiligt sind, und die entsprechenden Reste aus den geschlossenen Uba6- und Uba1-Strukturen sind markiert. Die geordnete Cys-Kappe in der offenen Struktur von Uba6 ist als Cartoon und cyanfarben dargestellt und die ungeordneten Cys-Kappen von Uba6 geschlossen und Uba1 sind als gestrichelte cyanfarbene Kreise dargestellt. d Die zusammengesetzte Omit-Dichtekarte (konturiert bei 1σ) für InsP6 in der offenen Uba6-Struktur wird als blaues Netz dargestellt. InsP6 wird als Stäbchen mit Kohlenstoffen (grün), Sauerstoff (rot) und Phosphaten (orange) dargestellt. Mit InsP6 interagierende Reste sind als Stäbchen und Wasserstoffbrückenbindungen als gestrichelte Linien dargestellt. e Die zusammengesetzte Auslassungsdichtekarte für die InsP6-Bindungstasche in der geschlossenen Uba6-Struktur ist wie in d dargestellt. InsP6 wurde basierend auf der offenen Uba6-Struktur modelliert. f Strukturbasiertes Sequenzalignment der InsP6-Bindungsregion in der Uba6- und Uba1-SCCH-Domäne. Die Sekundärstruktur für Uba6 ist oben dargestellt. Für die InsP6-Bindung wichtige Rückstände sind durch gelbe Sterne hervorgehoben. g Isotherme Titrationskalorimetriedaten für Wechselwirkungen zwischen den angegebenen Uba6- und Uba1-Varianten mit dem angegebenen Inositolphosphat. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die oberen Felder zeigen Rohleistungsdaten und die unteren Felder zeigen Anpassungen der Daten an Standardbindungsgleichungen mithilfe der NanoAnalyze-Software (TA-Instrumente). In der gesamten Abbildung beziehen sich die Bezeichnungen „Apo“ auf aus E. coli stammendes Material.

Interessanterweise beherbergen die Cys-Kappe und die Crossover-Schleife von Uba6 Reste, die an einem großen Netzwerk von Kontakten zu InsP6 außerhalb der Basistasche der globulären SCCH-Domäne beteiligt sind (Abb. 3a, d). Die Cys-Kappe bedeckt das InsP6-Molekül und trägt zwei basische Reste bei, Lys800 und Lys810, die an direkten und wasservermittelten Kontakten mit drei äquatorialen Phosphaten von InsP6 beteiligt sind (Abb. 3a, d). Darüber hinaus kontaktiert Lys628, das sich in der Nähe des katalytischen Cysteins auf Helix H18 innerhalb der Crossover-Schleife von Uba6 befindet, auch zwei äquatoriale Phosphate von InsP6. Insbesondere kann das Kontaktnetzwerk zwischen der Cys-Kappe, der Crossover-Schleife und InsP6 in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur nicht stattfinden, da die Cys-Kappe ungeordnet wird und die Crossover-Schleife während des SCCH-Domänenwechsels und der Aktivierung einen drastisch anderen Weg einschlägt Standortumgestaltung, die mit der Thiolierung einhergeht (Abb. 2a, c). In Übereinstimmung damit beobachten wir nur eine schwache Elektronendichte, die den axialen und äquatorialen Phosphaten von InsP6 in der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur entspricht, weshalb InsP6 nicht in das endgültige Modell einbezogen wurde (Abb. 3e). Das Andocken von InsP6 an die SCCH-Domäne der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur zeigt, dass es keine größeren sterischen Konflikte mit Uba6 gibt (ergänzende Abbildung 3b), was zusammen mit den obigen Daten auf eine Bindungsstelle mit geringer Affinität für InsP6 in der geschlossenen Konformation schließen lässt .

Während die an Kontakten mit InsP6 in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur beteiligten Reste eine 92–100 %ige Identität von Seeigeln mit Menschen aufweisen, zeigt der gleiche Vergleich, dass Uba1 in dieser Region mit vielen davon nur 8–25 % Identität mit menschlichem Uba6 aufweist die Unterschiede bei geladenen Resten (Abb. 3f). Folglich weist die entsprechende Region in Uba1 im Vergleich zu Uba6 deutlich andere Strukturmerkmale und Oberflächenelektrostatiken auf (Abb. 3c). Dies deutet darauf hin, dass sich die Fähigkeit zur Interaktion mit InsP6 zu einer spezifischen Funktion von Uba6 entwickelt hat, nicht jedoch von Uba1. Um diese Hypothese zu testen, haben wir Uba6 und Uba1 mithilfe von E. coli gereinigt und die Affinitäten für InsP6 mithilfe isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) gemessen. E. coli wurde verwendet, da dieser Organismus keine Inositphosphate oder Inositphospholipide produziert und InsP6 daher nicht zusammen mit den Proteinen gereinigt werden würde. Die Ergebnisse zeigen, dass bakteriell gewonnenes Uba6 zwar InsP6 mit einem KD von ~41 nM bindet, Uba1 jedoch unter den gleichen Bedingungen keine nachweisbare Bindung zeigt (Abb. 3g). Wir haben auch die Fähigkeit von Uba6 getestet, an die signalgebenden Inositolphosphate InsP3 (D-myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat) und InsP5 (D-myo-Inositol-1,3,4,5,6-pentakisphosphat) zu binden. die beide Vorläufer von InsP6 sind, und fanden heraus, dass sie auch mit Uba6 interagieren konnten, allerdings mit höheren KD-Werten von 248 bzw. 73 nM (Abb. 3g). Dies steht im Einklang damit, dass InsP3 und InsP5 jeweils das axiale Phosphat fehlt, das für die Bindung von InsP6 wichtig ist. Wichtig ist, dass die Mutation von Uba6-Resten, die die InsP6-Bindungstasche von Uba6 umfassen, zu den entsprechenden Aminosäuren von Uba1 (K644E/S648L/L702W/K706H/K709T/Y710Q; im Folgenden als Uba6_InsP6mut bezeichnet) die beurteilte Interaktion zwischen Uba6 und InsP6 vollständig aufhebt unter Verwendung von ITC (Abb. 3g und ergänzende Abb. 3c). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die InsP6-Bindung ein spezifisches Merkmal von Uba6 und nicht von Uba1 ist und dass die grundlegende Bindungstasche von Uba6 auch an andere signalgebende Inositphosphate wie InsP3 und InsP5 binden kann. Schließlich legt die hohe Affinität von Uba6 für InsP6 (~41 nM) in Verbindung mit intrazellulären Konzentrationen von InsP6 in eukaryontischen Zellen im Bereich von 10–100 μM43,44 nahe, dass diese Bindung physiologische Bedeutung hat. Es liefert auch eine Erklärung für die robuste Co-Reinigung von InsP6 mit Uba6, das in Insektenzellen exprimiert wird, selbst nach mehreren Reinigungsschritten.

Als nächstes untersuchten wir, ob InsP6 in der Lage ist, die Aktivität von Uba6 zu modulieren, indem wir die kinetischen Parameter vor dem stationären Zustand für die Bildung von Uba6~Ub- und Uba6~FAT10-Thioesterbindungen in Gegenwart und Abwesenheit von 50 μM InsP6 bestimmten. Diese Konzentration wurde ausgewählt, da es sich um die in der Literatur angegebene mittlere Zellkonzentration handelt. In diesen Tests wurde aus E. coli stammendes Uba6 verwendet, da E. coli, wie oben erwähnt, InsP6 nicht synthetisieren kann. Interessanterweise haben wir herausgefunden, dass die Michaelis-Konstante (Km) für Ub und FAT10 in Gegenwart und Abwesenheit von InsP6 ungefähr gleich ist, die beobachtete Geschwindigkeitskonstante (kobs) der Thioester-Zwischenproduktbildung Uba6~Ub und Uba6~FAT10 jedoch ~3 beträgt -4-fach langsamer in Gegenwart von InsP6 (Abb. 4a, b; Tabelle 1; und ergänzende Abbildungen 4–6). Bemerkenswert ist, dass die kinetischen Parameter für aus Insektenzellen stammendes Uba6 denen des aus E. coli stammenden Materials in Gegenwart von InsP6 ähnlich sind, was darauf hindeutet, dass das mitgereinigte InsP6 im aus Insektenzellen stammenden Material die katalytische Aktivität in ähnlicher Weise abschwächt (Abb. 4a, b und Tabelle 1).

a, b Kinetische Kurven von aus E. coli stammendem Uba6 in Gegenwart und Abwesenheit von InsP6 und von aus Insektenzellen stammendem Uba6 in Uba6~Ubl-Thioester-Aktivitätstests. In der gesamten Abbildung beziehen sich die Bezeichnungen „Apo“ auf aus E. coli stammendes Material. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt. c IC50-Kurven für die InsP6-Hemmung der Thioesterbildungsaktivitäten von Ub (links) und FAT10 (rechts) der angegebenen Uba6- und Uba1-Varianten. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt. d Auswirkungen von InsP6 und anderen Inositolpolyphosphaten auf die Thioesterbildungsaktivitäten Uba6~Ub (oben) und Uba6~FAT10 (unten) der angegebenen Uba6-Varianten. Die Tests wurden in Gegenwart und Abwesenheit von 100 μM InsPx(3, 5 oder 6) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt und als Prozentsätze des WT-Werts angezeigt, wobei einzelne Replikate als graue Kreise dargestellt werden. e Schmelztemperaturen der angegebenen SCCH-Domänenvarianten, bestimmt durch thermische Verschiebungstests in Gegenwart und Abwesenheit von 100 μM InsPx(3, 5 oder 6). Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt, wobei einzelne Replikate als graue Kreise dargestellt sind. Die den Abb. 4a–e zugrunde liegenden Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Auswirkungen von InsP6 auf die E1-Aktivität weiter zu bewerten, wurden Dosis-Wirkungs-Experimente mit E1~Ub- und E1~FAT10-Thioesterbildungstests unter Verwendung von Uba6_WT, Uba6_InsP6mut und Uba1_WT durchgeführt, die in E. coli mit InsP6-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 50 μM hergestellt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass InsP6 Uba6~Ub und Uba6~FAT10 mit IC50-Werten von 51 bzw. 67 nM (Abb. 4c und ergänzende Abb. 7a) hemmt, was mit der KD der Uba6/InsP6-Wechselwirkung, gemessen mit ITC (41 nM), übereinstimmt ). Wichtig ist, dass InsP6 die Uba6_InsP6mut-Aktivierung von Ub und FAT10 nicht hemmen konnte und InsP6 die Uba1-Aktivierung von Ub nicht hemmen konnte (Abb. 4c). Diese Ergebnisse zeigen weiter, dass die hemmende Wirkung von InsP6 spezifisch für Uba6 ist und durch die Bindung an die Basistasche seiner SCCH-Domäne vermittelt wird. Wir haben auch die Fähigkeit von InsP3 und InsP5 getestet, die Uba6-Aktivierung von Ub und FAT10 mithilfe von E1~Ub/FAT10-Thioesterbildungstests zu hemmen (Abb. 4d und ergänzende Abb. 7b). Diese Inositphosphate zeigen im Vergleich zu InsP6 eine deutlich verringerte Hemmung der Bildung von Uba6~Ub- und Uba6~FAT10-Thioester-Zwischenprodukten (Abb. 4d), was überraschend war, da sowohl InsP3 als auch InsP5 mit hoher Affinität an Uba6 binden (KD-Werte von 248 und 73 nM). , bzw.; Abb. 3g). Dieses Ergebnis weist auf eine wichtige Rolle des axialen Phosphats von InsP6 bei der Modulation der Uba6-Aktivität hin.

Als nächstes wurden thermische Verschiebungstests durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Bindung von Inositolphosphat die Stabilität von Uba6 beeinflusst, wobei sowohl vollständige als auch eigenständige SCCH-Domänenvarianten von Uba6 verwendet wurden (Abb. 4e und ergänzende Abb. 8). Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von InsP6 an die aus E. coli stammende Uba6-SCCH-Domäne die Schmelztemperatur von ~43 auf 59 °C erhöht, was der Schmelztemperatur von aus Insektenzellen stammendem Protein ähnelt (Abb. 4e). InsP3 und InsP5 erhöhen die Schmelztemperatur der aus E. coli stammenden Uba6-SCCH-Domäne von ~43 auf 47 bzw. 54 °C, wohingegen keines der Inositphosphate die Stabilität des aus Insektenzellen stammenden Proteins beeinträchtigt (Abb. 4e). Schließlich beeinflusste keines der Inositphosphate die thermische Stabilität der von E. coli abgeleiteten Uba6_InsP6mut-SCCH-Domäne (Abb. 4e), was erneut zeigt, dass die modulatorische Aktivität von Inositphosphaten auf Uba6 durch Bindung an die Basistasche der SCCH-Domäne vermittelt wird . Obwohl die Schmelzkurven aufgrund der Multidomänennatur von Uba6 komplizierter sind, sind die oben für die SCCH-Domäne von Uba6 beschriebenen Trends im Kontext von Uba6 in voller Länge ähnlich (ergänzende Abbildung 8).

Die Analyse unserer Uba6OPEN/Ub-AMP- und Uba6CLOSED/Ub-AMP-Strukturen liefert Einblicke in den molekularen Mechanismus, durch den die Bindung von InsP6 an Uba6 seine Aktivität und Stabilität moduliert. Wie oben erwähnt, befinden sich viele der Reste, die mit InsP6 in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur interagieren, in Regionen von Uba6, die ungeordnet werden müssen (Cys-Cap), deutlich unterschiedliche Konformationen annehmen (Crossover-Loop und H18) oder deutlich unterschiedliche Positionen einnehmen müssen aufgrund des SCCH-Domänenwechsels während des Übergangs zur geschlossenen Konformation zur Katalyse der Bildung von Thioesterbindungen (Abb. 2a – c). Dazu gehören Lys628 aus der Crossover-Schleife, Lys714 aus der SCCH-Domäne sowie Lys800 und Lys810 aus der Cys-Kappe, die zusammen an einem ausgedehnten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken mit äquatorialen Phosphaten von InsP6 in der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur beteiligt sind ( Abb. 5a, b). In der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur gehen alle diese Kontakte zu InsP6 verloren und stattdessen sind Lys628 und Lys714 an Salzbrücken mit Asp569 und Glu502 innerhalb des aktiven Zentrums beteiligt, die zur Stabilisierung der geschlossenen Konformation beitragen (Abb. 5a, B).

a, b Die offenen (a) und geschlossenen (b) Uba6-Strukturen sind als Oberflächendarstellungen dargestellt, mit Ausnahme der SCCH-Domänen, die als Schleifen dargestellt sind. Elemente, die beim Übergang vom Adenylierungs- zum Thiolierungs-fähigen Zustand Konformationsänderungen in der SCCH-Domäne erfahren, werden als Cartoons dargestellt. Ausgewählte Aminosäuren werden als Kugeln dargestellt. InsP6 und AMP werden als Stäbchen dargestellt. Ungeordnete Zystenkappen werden als cyanfarbene Kreise dargestellt. c SCCH-Domäne aus der offenen Uba6-Struktur, modelliert in der geschlossenen Konformation. Das offene SCCH (dargestellt als Schleifen) wurde der SCCH-Domäne der geschlossenen Uba6-Struktur überlagert, wobei Uba6 als Oberflächendarstellung gezeigt wurde. Der sterische Konflikt zwischen Elementen von SCCH [offen], einschließlich Cys-Cap, Helix 18, Crossover-Loop und Reentry-Loop mit Uba6, wird durch gestrichelte rote Rechtecke hervorgehoben. d Struktur-Funktions-Analyse der in a und b dargestellten Uba6-Seitenketten in Ub-AVSN-Vernetzungstests, die Adenylierung und Thiolierung entkoppeln und die Thiolierungsaktivität spezifisch bewerten (links). In der gesamten Abbildung bezieht sich „Apo“ auf aus E. coli stammendes Material. Schematische Darstellung von Ub-AVSN und der Uba6-Ub-AVSN-Vernetzung (rechts). Das während der Reaktion mit Uba6 angegriffene elektrophile Zentrum ist durch einen schwarzen Stern gekennzeichnet. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt und als Prozentsätze des WT-Werts angezeigt, wobei einzelne Replikate als graue Kreise dargestellt werden. e Struktur-Funktions-Analyse der in a und b dargestellten Uba6-Seitenketten in Uba6~Ub-Thiolierungstests, die sowohl Adenylierung als auch Thiolierung erfordern. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM (n = 3 technische Replikate) dargestellt und als Prozentsätze des WT-Werts angezeigt, wobei einzelne Replikate als graue Kreise dargestellt werden. Die den Abbildungen 5d und e zugrunde liegenden Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Dies führt zu der Hypothese, dass die Bindung von InsP6 an Uba6 seine Aktivität hemmt, indem es die offene Konformation von Uba6 stabilisiert und dadurch die Bildung der für die Thiolierung notwendigen geschlossenen Konformation behindert. Dies geschieht durch InsP6-vermittelte Stabilisierung der Cys-Kappe, die das katalytische Cystein bedeckt und mit der Adenylierungsdomäne kollidieren würde, wenn sie in der geschlossenen Konformation geordnet bleiben würde (Abb. 5c), und durch Stabilisierung der Crossover-Schleife (einschließlich des katalytischen Cysteins, das H18 enthält). in einer Konformation, in der das katalytische Cystein vom aktiven Zentrum entfernt ist. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese stellten wir fest, dass die Modulationsaktivität von InsP6 in K628A- und K714D-Mutanten von Uba6 sowohl in Uba6~Ub-Thioesterbildungsaktivitätstests als auch in Uba6-Ub-AVSN-Vernetzungstests signifikant verringert ist (Abb. 5d und ergänzende Abb. 9a). , B). Ub-AVSN45,46 enthält ein elektrophiles Vinylsulfonamid, das die Adenylierungs-Halbreaktion umgeht und dadurch speziell als Anzeige für die Thiolierungs-Halbreaktion dient, indem es das ankommende E1-Cystein-Nukleophil kovalent abfängt25,31. Darüber hinaus erhöhte sich die KD der K714D-Uba6/InsP6-Wechselwirkung um das ~30-fache (von 41 nM auf 1,45 μM) (ergänzende Abbildung 9c), was im Einklang mit dem Verlust von Wasserstoffbrückenbindungen zum 6'-Phosphat und weitreichenden elektrostatischen Wechselwirkungen steht mit dem 5'-Phosphat von InsP6. Ebenfalls im Einklang mit unserer Hypothese zeigen sowohl die E502A- als auch die D569A-Mutante eine stark verminderte Aktivität sowohl bei der Uba6~Ub-Thioesterbildung als auch bei Uba6-Ub-AVSN-Vernetzungstests (Abb. 5d).

Insgesamt legen unsere Daten nahe, dass InsP6 Folgendes vermittelt: (1) Stabilisierung flexibler Schleifen innerhalb der SCCH-Domäne (Cys-Cap, Crossover-Loop), (2) Stabilisierung der SCCH-Domäne in der offenen Konformation und im weiteren Sinne Versteifung von H1/H2, und g6-Strukturelemente innerhalb des aktiven Zentrums und (3) Stabilisierung der globulären SCCH-Domäne selbst durch Überbrücken der beiden Lappen der Domäne miteinander (Abb. 3a). Dies führt uns zu der Hypothese, dass diese Merkmale gemeinsam zur signifikanten Erhöhung der thermischen Stabilität des Uba6/InsP6-Komplexes im Vergleich zu Uba6 allein beitragen (Abb. 4e und ergänzende Abb. 8). Tatsächlich könnte dies die deutlich höhere Ausbeute an rekombinantem Uba6 bei der Expression in Insektenzellen im Vergleich zur Expression in E. coli erklären.

In diesem Manuskript präsentieren wir strukturelle Schnappschüsse von Uba6, die zusammen die molekularen Mechanismen aufdecken, durch die Adenylierung und Thiolierung durch dieses Enzym katalysiert werden. Die Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur stellt den Produktkomplex der Adenylierung nach der Freisetzung von PPi/Mg2+ dar und die Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur stellt den Komplex dar, der für die Katalyse der Thiolierung bereit ist. Ein Vergleich der offenen und geschlossenen Strukturen zeigt, dass der SCCH-Domänenwechsel und die Umgestaltung des aktiven Zentrums das aktive Adenylierungszentrum zerlegen und es für die Thiolierungsreaktion neu konfigurieren, indem für die Katalyse wichtige Reste in das aktive Zentrum ausgetauscht werden. Die Helix H14 von Uba6 ist so positioniert, dass sie das Oxyanionloch des aktiven Zentrums bildet, indem sie ein komplementäres positives elektrostatisches Potenzial zur Stabilisierung des Übergangszustands und des tetraedrischen Zwischenprodukts bereitstellt, das sowohl während der Adenylierung als auch der Bildung der Thioesterbindung gebildet wird.

Während viele der herausragenden mechanistischen Merkmale der Katalyse der Adenylierung und Thiolierung bei anderen E1s wie Uba125 und dem E1 für SUMO31 konserviert sind, offenbaren unsere Strukturen von Uba6 ein unerwartetes und einzigartiges Merkmal von Uba6; nämlich die hochbasische Tasche auf der SCCH-Domäne, die InsP6 bindet und dazu dient, sowohl die Aktivität als auch die Stabilität des Enzyms zu modulieren. Die Nähe der InsP6-Bindungsstelle zu Strukturelementen, die eine Schlüsselrolle beim SCCH-Domänenwechsel und der Umgestaltung des aktiven Zentrums spielen, liefert eine Erklärung dafür, wie InsP6 die Uba6-Aktivität moduliert. Unsere Daten legen nahe, dass die InsP6-vermittelte Verringerung der Uba6-Aktivität auf die Stabilisierung von Strukturelementen zurückzuführen ist, die beim Übergang vom adenylierungskompetenten zum thiolierungskompetenten Zustand Konformationsänderungen erfahren. Interessanterweise deuten unsere Daten darauf hin, dass diese Wechselwirkungen über dieselben Mechanismen zur thermischen Stabilität von Uba6 beitragen. Unsere Ergebnisse ähneln denen für einen allosterischen SUMO E1-Inhibitor namens COH00032. Obwohl sich seine Bindungsstelle im Vergleich zu InsP6 völlig unterscheidet, bindet COH000 auch eine Tasche, die sich in der Nähe von Strukturelementen befindet, die für den Wechsel der SCCH-Domäne und die Umgestaltung des aktiven Zentrums von entscheidender Bedeutung sind, und nutzt diese mechanistischen Merkmale als Teil seines Hemmmechanismus32. Die Entdeckung von COH000 führte zu Spekulationen darüber, dass E1-Enzyme durch natürlich vorkommende zelluläre Metaboliten allosterisch reguliert werden könnten, und tatsächlich ist InsP6 das erste Beispiel dieser Art.

Unsere Daten zeigen insbesondere, dass Uba6 auch andere Inositphosphate binden kann. Dazu gehören die sekundären Botenstoffe InsP3 und InsP5, die mit nanomolarer Affinität binden, die Aktivität von Uba6 jedoch nicht in dem Maße hemmen wie InsP6 (Abb. 3g). Im Gegensatz dazu kann Myo-Inositol (dem Phosphate fehlen) nicht mit nachweisbarer Affinität an Uba6 binden. Im Prinzip können mehr als 63 phosphorylierte InsPs durch sequentielle Phosphorylierung von Myoinositol erzeugt werden, und es bleibt abzuwarten, wie die unglaubliche Komplexität der Vielfalt der Inositolphosphate mit der Uba6-Funktion interagieren könnte47,48. Im Vergleich zu Uba6 weist Uba1 eine völlig andere Struktur und Oberflächenladungsverteilung in der Region auf, die der Inositolpolyphosphat-Bindungsstelle von Uba6 entspricht, und interagiert nicht nachweisbar mit Inositolpolyphosphaten (Abb. 3g). Es ist interessant zu spekulieren, dass die einzigartige Fähigkeit von Uba6, mit Inositpolyphosphaten zu interagieren, der Beobachtung zugrunde liegen könnte, dass nur die Hälfte der zu jedem Zeitpunkt in der Zelle vorhandenen Uba6-Moleküle mit Ub/FAT10 aktiviert werden, im Vergleich zu fast allen Uba1-Molekülen, die in der aktivierten Zelle vorhanden sind Zustand6,33. Die Zahl der an der Ub/FAT10-Signalübertragung beteiligten Enzyme, die nachweislich mit Inositolphosphaten interagieren und/oder durch diese reguliert werden, nimmt stetig zu. Die ersten nachgewiesenen Beispiele sind die InsP5- und InsP6-Regulierung der Cullin-RING-E3-Ub-Ligasefunktion in Pflanzen und Menschen36. 37,38,39. Dies deutet darauf hin, dass es möglicherweise eine Untergruppe der Ub/FAT10-Signalachsen gibt, die durch Inositolphosphate reguliert werden und bestimmte zelluläre Prozesse steuern. Aus einer breiteren Perspektive ist der Ub/FAT10-Signalweg einer von mehreren Signalwegen, von denen mittlerweile bekannt ist, dass sie durch hochaffine Wechselwirkungen mit Inositolphosphat-Second-Messengern reguliert werden, und legt nahe, dass wir gerade erst beginnen, die Rolle dieser Moleküle in der Zellbiologie zu verstehen49 ,50.

Schließlich ist es interessant zu spekulieren, dass andere negativ geladene zelluläre Metaboliten oder Makromoleküle in bestimmten zellulären Kontexten in die grundlegende Bindungstasche von Uba6 eingreifen könnten.

Beispielsweise interagieren Phosphoinositide, die eine Vielzahl phosphorylierter Inositol-Kopfgruppen enthalten, auf regulierte Weise mit einer Vielzahl zellulärer Proteine. Diese phosphorylierten Inositol-Kopfgruppen dienen als Vorläufer für lösliche Inositphosphate wie InsP3, InsP4, InsP5 und InsP6, von denen wir gezeigt haben, dass sie Uba6 mit hoher Affinität binden. Dies deutet darauf hin, dass Uba6 möglicherweise mit bestimmten Phosphoinositiden interagieren kann, was neben der Regulierung seiner Aktivität und Stabilität auch als Mechanismus zur Veränderung seiner subzellulären Lokalisierung dienen könnte. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass über Rollen sowohl von Uba6 als auch von Phosphoinositiden bei der Autophagie berichtet wurde51,52. Ebenso unterstreicht diese Studie die Möglichkeit, dass andere E1 als Regulationsmechanismus andere natürlich vorkommende zelluläre Metaboliten binden können. Dementsprechend haben wir zuvor eine kleine Tasche auf der Oberfläche der SCCH-Domäne von Uba1 identifiziert, die voraussichtlich ein Ligandenbindungs-Hotspot ist (Hotspot 3)23. Die Struktur und Elektrostatik von Hotspot 3 in Uba1 unterscheidet sich von der InsP6-Bindungsstelle von Uba6 (Abb. 3a – c), und daher würde jede Metabolit- oder Makromolekülbindung an dieser Stelle im Vergleich zu Inositphosphaten andere strukturelle und physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen.

Während unsere Arbeit die molekularen Mechanismen beleuchtet hat, durch die Uba6 die Adenylierung und Thiolierung katalysiert, und auch unerwartet einen durch einen zellulären Metaboliten vermittelten Regulierungsmechanismus aufgedeckt hat, bleibt über dieses Enzym noch viel zu lernen. Dazu gehört die Aufklärung, welche Rolle die Bindung von Inositolphosphat bei der Regulierung der Funktion von Uba6 in Zellen spielt und ob auch andere zelluläre Faktoren die Basistasche der SCCH-Domäne binden, um deren Aktivität zu modulieren. Zu den weiteren Fragen gehören die Definition der molekularen Regeln, die die duale Spezifität von Uba6 sowohl für Ub als auch für FAT10 regeln, und die Aufklärung des Mechanismus für die Übertragung dieser Ub/Ubls auf das Uba6-verwandte E2-konjugierende Enzym Ube2Z. In diesem Zusammenhang überlappt die InsP6-Bindungsstelle von Uba6 mit der vorhergesagten E2-Bindungsoberfläche seiner SCCH-Domäne und es wird spannend sein zu bestimmen, ob InsP6 eine Rolle bei der E1-E2-Ub-Transthioesterung spielt. Schließlich werden unsere Uba6/Ub-AMP-Strukturen und insbesondere die Unterschiede zum aktiven Zentrum von menschlichem Uba1 einen Rahmen für Arzneimittelforschungsbemühungen bieten, die speziell auf dieses Enzym für therapeutische Interventionen bei Krebs und anderen Krankheiten abzielen.

Für die E. coli-Expression wurde das DNA-Fragment, das für die menschlichen Uba6-Reste 37–1052 kodiert, in NdeI/NotI-Stellen des Vektors pSMT3.2 mit einem N-terminalen ULP1-spaltbaren SMT3-Tag53 kloniert. Das DNA-Fragment, das für die menschliche Uba6-SCCH-Domäne (Reste 615–892) oder die menschliche Uba1-SCCH-Domäne (Reste 625–892) kodiert, wurde synthetisiert (Gene Universal) und in NdeI/NotI-Stellen des Vektors pSMT3.4 mit einem N-terminalen ULP1- eingefügt. spaltbares SMT3-Tag. Das für menschliches Ubiquitin kodierende DNA-Fragment wurde mit einem N-terminalen TEV-spaltbaren 6 × His-Tag in NcoI/XhoI-Stellen des Vektors pET29NTEV eingefügt. Das DNA-Fragment, das für menschliches FAT10 (C7T/C9T/C134L/C160S/C162S)40 kodiert, wurde synthetisiert und in die BamHI/NotI-Stellen des Vektors pGEX-6P1 eingefügt. Weizen-Ubiquitin mit seinen sieben zu Arginin mutierten Lysinen (UbK7R) wurde wie zuvor beschrieben hergestellt54. Für die Expression von Insektenzellen wurde das DNA-Fragment, das für die menschlichen Uba6-Reste 37–1052 kodiert, in NcoI/NotI-Stellen von pFastBac HTB mit einem N-terminalen TEV-spaltbaren 6× His-Tag kloniert. Das katalytische Cystein Cys625 wurde zur Kristallisation zu Alanin mutiert. Das DNA-Fragment, das für die menschliche Uba6-SCCH-Domäne (Reste 615–892) kodiert, wurde in BamH/NotI-Stellen von pFastBac HTB mit einem N-terminalen TEV-spaltbaren 6× His-Tag kloniert. Alle Punktmutationen wurden mittels PCR-basierter ortsgerichteter Mutagenese eingeführt. Alle Konstrukte und Punktmutationen wurden unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 2 beschriebenen Primerpaare generiert.

Alle in E. coli BL21 (DE3) Codon Plus-Zellen (Agilent; Kat.-Nr. 230280) exprimierten Proteine ​​wurden wie zuvor beschrieben hergestellt23. Kurz gesagt, Kulturen im großen Maßstab wurden bei 37 °C in Luria-Bouillon-Medium bis zu einer OD von 2,0 A600 gezüchtet und dann für einen Kälteschock unter Zusatz von 1,5 % Ethanol (v/v) in ein Eisbad gegeben. Nach 30 Minuten wurde das Protein durch Zugabe von Isopropyl-β-d-1-thioglactiosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 0,1 mM induziert und anschließend über Nacht bei 18 °C geschüttelt. Das Bac-to-Bac-Baculovirus-Expressionssystem wurde verwendet, um menschliches Uba6 in Insektenzellen zu exprimieren. Rekombinante Baculoviren mit hohem Titer wurden verwendet, um BTI-Tn-5B1–4 (Hi5)-Zellen (ThermoFisher Scientific; Kat.-Nr. B85502) bei einer Zelldichte von 2 × 106 Zellen/ml zu infizieren, die in Sf-900 II SFM-Medium (ThermoFisher) kultiviert wurden Wissenschaftlich). Die Zellen wurden nach 48-stündiger Infektion geerntet und vor der weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Von Bakterien oder Insektenzellen exprimierte Uba6-Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung in Lysepuffer (20 mM Tris HCl pH 8,0, 350 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 0,5 mM TCEP) in Gegenwart von DNase und Lysozym lysiert. Das Zelllysat wurde 30 Minuten lang bei 39.191 × g zentrifugiert und der Überstand dann auf Ni-NTA-Harz (QIAGEN) aufgetragen und das Protein in Puffer 20 mM Tris HCl pH 8,0, 350 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 0,5 mM eluiert TCEP. Der SMT3-Tag wurde durch Zugabe von ULP1-Protease in einem Verhältnis von 1:2000 (Gew./Gew.) und Inkubation über Nacht bei 4 °C gespalten. Der 6× His-Tag wurde durch Zugabe von TEV-Protease im Verhältnis 1:100 (Gew./Gew.) und Inkubation über Nacht bei 4 °C gespalten. Nach der Spaltung wurde das Protein einer Superdex 200-Gelfiltration (GE Healthcare) mit Puffer 20 mM Tris HCl pH 8,0, 350 mM NaCl, 0,5 mM TCEP unterzogen, und später wurde das Zielprotein gepoolt und einer MonoQ-Anionenaustauschsäule (GE Healthcare) unterzogen ) mit Puffer (Puffer A: 20 mM Tris HCl pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1 mM TCEP; Puffer B: 20 ​​mM Tris HCl pH 8,0, 1000 mM NaCl, 0,1 mM TCEP) zur weiteren Reinigung. Die Uba6-SCCH-Domäne und die Uba1-SCCH-Domäne wurden wie für Uba6 beschrieben gereinigt, mit der Ausnahme, dass eine Superdex 75-Säule (GE Healthcare) anstelle von Superdex 200 verwendet wurde. FAT10 wurde durch GST-Affinitätschromatographie und Superdex 75-Gelfiltration (GE Healthcare) gereinigt. Menschliches Ubiquitin und Weizen-UbK7R wurden durch Ni-NTA-Affinität und Superdex 75-Gelfiltration (GE Healthcare) gereinigt. Nach der Reinigung wurden die Proteine ​​auf 5–10 mg/ml konzentriert, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Uba6 C625A wurde wie oben beschrieben bei einer Endkonzentration von 115 μM in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM TCEP gereinigt. Weizen-UbK7R (230 μM), MgCl2 (5 mM) und ATP (1 mM) wurden vor dem Sparse-Matrix-Screening in Intelli-Plate (Art Robbins Instruments) bei 18 °C zugegeben. Kristalle des Uba6/Ub-Komplexes in Beugungsqualität wurden durch Mischen von 1 μl Proteinprobe mit 1 μl Kristallisationspuffer (100 mM MES pH 6,4, 140 mM NaF, 15 % PEG3350) gezüchtet. Die Kristalle wurden in flüssigem Stickstoff in einem Kryoschutzmittel aus Mutterlauge, ergänzt mit 30 % PEG3350, schockgefroren.

Ein vollständiger Röntgenbeugungsdatensatz eines einzelnen Uba6/Ub-Kristalls wurde mit einer Auflösung von 2,25 Å an der Advanced Photon Source (Argonne, IL), NE-CAT-Beamline 22-ID-E, gesammelt. Alle Daten wurden mit HKL200055 indiziert, integriert und skaliert. Die Kristalle gehören zur Raumgruppe C2 mit den Elementarzellenabmessungen a = 248,6 Å, b = 101,3 Å, c = 122,9 Å und α = 90°, β = 118°, γ = 90°, mit zwei hUba6/Ub-Komplexen pro Asymmetrie Einheit.

Mit dem Programm Sculptor wurde ein Modell des menschlichen Uba6 basierend auf den Koordinaten von H. sapiens Uba1 (PDB: 6DC6)23 erstellt. Anschließend wurde das Programm PHASER56 verwendet, um mithilfe der Koordinaten für die einzelnen Domänen (AAD/IAD-, FCCH-, SCCH- und UFD-Domänen) des Uba6-Sculptor-Modells und Weizen-Ub (PDB: 4II2) eine molekulare Ersatzlösung zu finden. Das Modell wurde durch iterative Verfeinerungs- und Neuaufbaurunden mit PHENIX57 und COOT58 auf R/Rfree-Werte von 0,166/0,206 verfeinert. Die erste Verfeinerungsrunde umfasste die Starrkörperanpassung von AAD/IAD, FCCH, SCCH und UFD von hUba6 und Ub. Nach der ersten Verfeinerungsrunde stimmte die starke und kontinuierliche Elektronendichte an den C-Termini beider Ub-Moleküle im AU mit dem Ub-Adenylatprodukt überein, und AMP und die Glycylphosphatbindung wurden anschließend nach mehreren weiteren Schritten in die Elektronendichte eingebaut Runden Modellbau und Verfeinerung. In der Uba6OPEN/Ub-AMP-Struktur beobachteten wir auch eine starke Elektronendichte innerhalb einer Tasche der SCCH-Domäne, die wir aufgrund der sechsfachen Symmetrie der Dichte und der umgebenden chemischen Umgebung einem InsP6-Molekül zuordneten. Während der letzten Verfeinerungsrunden haben wir manuell ein InsP6 in die Dichte eingefügt, was eine gute Verfeinerung bewirkte. In der Uba6CLOSED/Ub-AMP-Struktur ist die Elektronendichte für InsP6 mit Ausnahme der Position, die dem axialen Phosphat von InsP6 entspricht, deutlich schwächer und daher wurde InsP6 nicht modelliert.

Das endgültige hUba6/Ub-AMP-Modell enthält die Aminosäuren 1–76 aus beiden Kopien von Ub (Ketten B und D), die Aminosäuren 40–1050 aus Kopie A von Uba6 und die Aminosäuren 59–798 und 819–1049 aus Kopie C von Uba6. Das Modell enthält zwei AMP-Moleküle aus den Ub-AMP-Zwischenprodukten der Kette B und D, ein mit der Uba6-Kette A assoziiertes InsP6-Molekül und 846 Wassermoleküle. Das endgültige Modell hat eine gute Geometrie mit 97,1, 2,7 und 0,2 % der Reste in den bevorzugten, erlaubten bzw. nicht erlaubten Regionen des Ramachandran-Raums. Alle molekulargrafischen Darstellungen der Strukturen wurden mit PyMOL59 erstellt. Strukturausrichtungen wurden mit dem Programm Superpose in der CCP4-Softwaresuite60 durchgeführt.

ITC-Experimente wurden auf einem Affinity ITC (TA-Instrumente) bei 25 °C in Puffer mit 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,5 mM TCEP durchgeführt. Aliquote (jeweils 2,5 μl) von 100 μM InsP3 (D-myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat-triammoniumsalz, Santa Cruz), InsP5 (D-myo-Inositol-1,3,4,5,6-pentakisphosphat-Pentakaliumsalz). , Enzo) oder InsP6 (Phytinsäure-Natriumsalzhydrat, Sigma-Aldrich) wurden in eine Zelle injiziert, die 10 μM Volllängen- oder SCCH-Domäne von E1-Proteinen oder Ubl enthielt. Es wurden 20 Messungen durchgeführt und die Daten mit NanoAnalyze (TA-Instrumente) analysiert. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Gelbasierte E1-Thioesterbildungstests wurden mit 100 nM E1, 2,5 μM Ubl, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % Glycerin und 0,1 mM durchgeführt TCEP bei Raumtemperatur (RT). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von ATP initiiert und durch Zugabe von nichtreduzierendem Harnstoff-SDS-PAGE-Puffer beendet und 60 Minuten lang 4–12 % NuPAGE Bis-Tris-Gel (Life Technologies) bei konstant 150 V ausgesetzt. Die Gele wurden mit Sypro Ruby (BioRad) gefärbt und mit einem ChemiDoc MP (BioRad) sichtbar gemacht. Die Datenquantifizierung wurde mithilfe der Densitometrie in der Software ImageJ 1.53 durchgeführt und mit Prism 7.0a (GraphPad) analysiert. Densitometriemessungen wurden als Prozentsatz des Kontroll-WT-Assays auf demselben Gel normalisiert. Die Daten werden als Durchschnitt von drei technischen Replikaten mit ±Standardabweichungs-Fehlerbalken dargestellt. Unverarbeitete Bilder repräsentativer Gele für alle biochemischen Tests werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Alle E1~Ubl-Inhibitionstests wurden durch Inkubation von 100 nM des angegebenen E1 mit 100 μM InsPx (IP3, IP5 oder IP6) in einem Puffer durchgeführt, der 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4, enthielt. und 5 mM MgCl2 für 5 Minuten bei RT. Anschließend wurden ATP und das entsprechende Ubl bis zu einer Endkonzentration von 500 bzw. 2,5 μM zugegeben. Die Reaktionen wurden 2 s lang bei RT inkubiert und unter Verwendung eines nicht reduzierenden Harnstoff-SDS-PAGE-Puffers beendet. Alle Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefärbt, sichtbar gemacht und quantifiziert, wie oben für E1~Ubl-Aktivierungstests beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Densitometriemessungen als Prozentsatz des Kontroll-WT ohne InsPx-Test auf demselben Gel normalisiert wurden.

Die Vernetzung von Wildtyp- und Mutantenkonstrukten von E1 mit Ub-AVSN wurde in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 100 nM E1, 500 nM Ub-AVSN, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 enthielt % Glycerin und 0,5 mM TCEP bei RT für 1 Minute und denaturiert in reduzierendem SDS-PAGE-Puffer. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefärbt, sichtbar gemacht und quantifiziert, wie oben für E1~Ubl-Aktivierungstests beschrieben.

Die Fluoreszenzmarkierung von UblCys0 mit CF488A-Maleimid (Biotium) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, 50 μM UblCys0 wurden mit 150 μM CF488A-Farbstoff in Konjugationspuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM TCEP) über Nacht bei RT inkubiert. Die Reaktionen wurden dann mit 5 mM DTT gelöscht und verdünnt, um die NaCl-Konzentration auf 50 mM zu senken. Die resultierende Mischung wurde einer EnrichS-Säule (BioRad) unterzogen und mit einem linearen Gradienten eluiert (für UbCF488A 50 mM NH4Ac, pH 4,51, 50–1000 mM NaCl; für FAT10CF488A 20 mM Bis-Tris, pH 6,5, 50–1000). mM NaCl). Gereinigtes UblCF488A wurde gepoolt und konzentriert.

Die Reaktionen wurden ähnlich wie die oben beschriebene E1~Ubl-Thioesterbildung durchgeführt, mit einigen Modifikationen. Die Reaktionen enthielten 100 nM E1, 0,1–10 μM UblCF488A, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % Glycerin und 0,1 mM TCEP für 2 s bei Raum Temperatur (RT). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von ATP initiiert und durch Zugabe von nichtreduzierendem Harnstoff-SDS-PAGE-Puffer beendet und 60 Minuten lang 4–12 % NuPAGE Bis-Tris-Gel (Life Technologies) bei konstant 150 V ausgesetzt. Die Gele wurden auf ChemiDoc MP (BioRad) mit dem Alex488-Kanal abgebildet. Alle Gele wurden mit einer Reihenverdünnung einer bekannten Menge FAT10CF488A abgebildet, sodass jedes Gel eine Standardkurve zur Umrechnung der Bandenintensität in Nanomol FAT10CF488A mit der Software ImageJ 1.53 enthielt, und mit Prism 7.0a (GraphPad) analysiert, indem Datenpunkte in Michaelis– Menten-Modell. Proben aus jeder Substratkonzentration wurden in dreifacher Ausfertigung entnommen.

Die Reaktionen enthielten 100 nM E1, 2,5 μM UblCF488A, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % Glycerin und 0,1 mM TCEP für verschiedene Zeitpunkte (0– 20 s) bei Raumtemperatur (RT). Für kurze Zeiträume (25 ms, 100 ms, 500 ms, 1 s) wurden die Reaktionen auf dem QFM-4000 Rapid-Quench-Flow-Instrument durchgeführt. Um die Reaktion zu starten, wurden 20 μl einer Lösung, die E1 und ATP in Spritze 1 enthielt, schnell mit 20 μl einer Lösung, die UblCF488A in Spritze 2 enthielt, bei RT gemischt, die Reaktion wurde dann mit 20 μl 1 N HCl/3 × nicht Reduzierung des Harnstoff-SDS-PAGE-Ladepuffers. Für lange Zeiträume (2 s, 5 s, 10 s, 20 s) wurden die Reaktionen manuell durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von ATP initiiert und durch Zugabe von nichtreduzierendem Harnstoff-SDS-PAGE-Puffer beendet. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefärbt, sichtbar gemacht und quantifiziert, wie oben beschrieben, um den Km-Wert der Uba6~UblCF488A-Thioesterbildung abzuschätzen.

Gelbasierte E1~Ubl-Inhibitionstests wurden durchgeführt, indem 100 nM des angegebenen E1 mit 0–50 μM InsP6 in einem Puffer inkubiert wurden, der 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4 und 5 mM MgCl2 enthielt für 5 Min. bei RT. Anschließend wurden ATP und das entsprechende Ubl bis zu einer Endkonzentration von 500 μM bzw. 2,5 μM zugegeben. Die Reaktionen wurden 2 s lang bei RT inkubiert und unter Verwendung eines nicht reduzierenden Harnstoff-SDS-PAGE-Puffers beendet. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefärbt und sichtbar gemacht, wie oben für E1~Ubl-Aktivierungstests beschrieben. Die Datenquantifizierung wurde mithilfe der Densitometrie in der Software ImageJ 1.53 durchgeführt und mit Prism 7.0a (GraphPad) analysiert, indem Datenpunkte in ein Log(Inhibition)-Reaktionsmodell mit drei Parametern eingepasst wurden. Die Daten werden als Durchschnitt von drei technischen Replikaten mit ±Standardabweichungs-Fehlerbalken dargestellt. Unverarbeitete Bilder repräsentativer Gele für alle biochemischen Tests werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

2 μg Volllängen- oder SCCH-Domäne von E1-Proteinen wurden mit 5 × SYPRO Orange-Farbstoff (Thermo Fisher) in 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,25 mM TCEP zu 20 μl in einer optischen MicroAmp Fast-Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen gemischt ( Lebenstechnologien). Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung hergestellt. Die 96-Well-Welle wurde mit MicroAmp Optical Adhesive Film (Life Technologies) versiegelt und dann in QuantStudio 3 qRT-RCR (Applied Biosystems) platziert. Es wurde die Schmelzkurvenmethode durchgeführt: kontinuierliche Sammlung wurde ausgewählt; 25 °C 2 Min., 1,6 °C/s; 0,05 °C/s Rampe; 95 °C 2 Min. Die Daten wurden für die weitere Erstellung von Schmelzkurven und die Bestimmung der Schmelztemperatur mit Prism 7.0a (GraphPad) gespeichert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren sind in der Protein Data Bank (PDB) mit dem Zugangscode 7SOL hinterlegt. Zuvor veröffentlichte Strukturdaten, die aus dem PDB verwendet wurden, sind unten aufgeführt: PDB: 6DC6, PDB: 4II2, PDB: 6GF2. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Patrick Sung und Miklos Bekes für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Röntgenbeugungsdaten wurden an der Strahllinie NE-CAT 24-ID-E an der Advanced Photon Source des Argonne National Laboratory gesammelt. Diese Arbeit basiert auf Forschungsarbeiten, die an den Strahllinien des Northeastern Collaborative Access Team durchgeführt wurden, die vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (P30 GM124165) finanziert werden. Der Eiger 16M-Detektor auf 24-ID-E wird durch einen NIH-ORIP HEI-Zuschuss (S10OD021527) finanziert. Diese Forschung nutzte Ressourcen der Advanced Photon Source, einer Benutzereinrichtung des Office of Science des US-Energieministeriums (DOE), die vom Argonne National Laboratory unter der Vertragsnummer DE-AC02-06CH11357 für das DOE Office of Science betrieben wird. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse wurden von NIH R01 GM115568, R01 GM128731 und CPRIT RR200030 (SKO) unterstützt. Diese Forschung nutzte Ressourcen der Structural Biology Core Facilities, die Teil der Institutional Research Cores am Health Science Center der University of Texas in San Antonio sind, unterstützt vom Büro des Vizepräsidenten für Forschung und der gemeinsamen Ressource Drug Discovery and Structural Biology des Mays Cancer Center (NIH P30 CA054174). Der Rigaku HyPix-6000HE-Detektor, das Universal-Goniometer und die optische VariMax-VHF-Instrumentierung in den Strukturbiologie-Kerneinrichtungen werden durch den NIH-ORIP SIG Grant S10OD030374 finanziert. Der Inhalt dieser Studie liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH wieder.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lingmin Yuan, Fei Gao.

Abteilung für Biochemie und Strukturbiologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Lingmin Yuan, Fei Gao, Zongyang Lv, Digant Nayak, Anindita Nayak, Priscilla Dos Santos Bury, Christine E. Cano, Lijia Jia, Elizabeth V. Wasmuth und Shaun K. Olsen

Abteilung für Forschung und Entwicklung, Beijing IPE Center for Clinical Laboratory CO, Peking, 100176, China

Fei Gao

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie und Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, 29425, USA

Natalia Oleinik, Firdevs Cansu Atilgan & Besim Lehrerin

Abteilung für Pädiatrie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21287, USA

Katelyn M. Williams

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of South Alabama, Mobile, AL, 36688, USA

Christopher Davies

UbiQ Bio BV, Science Park 408, 1098 XH, Amsterdam, Niederlande

Farid El Oualid

Programm für Humanonkologie und Pathogenese, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Elizabeth V. Wasmuth

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Die Proteinreinigung wurde mit von FG, LY, DN, AN und PSBFEO synthetisierten, gereinigten und validierten aktivitätsbasierten Sonden durchgeführt. Strukturelle Experimente und Analysen wurden von FG, LY, ZL und SKOLY durchgeführt und FG führte biochemische und biophysikalische Untersuchungen durch. EVW, KEC, LJ, FCA, BO, KMW und CD unterstützten bei der experimentellen Gestaltung und Dateninterpretation. Die Abbildungen und das Manuskript wurden von LY, FG und SKO unter Mitwirkung aller Autoren erstellt.

Korrespondenz mit Shaun K. Olsen.

FEO erklärt konkurrierende finanzielle Interessen als Mitbegründer und Anteilseigner von UbiQ Bio BV. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yuan, L., Gao, F., Lv, Z. et al. Kristallstrukturen enthüllen katalytische und regulatorische Mechanismen des Ubiquitin/FAT10 E1-Enzyms Uba6 mit doppelter Spezifität. Nat Commun 13, 4880 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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Eingegangen: 20. März 2022

Angenommen: 08. August 2022

Veröffentlicht: 19. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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