Der Einfluss der Holliday-Junction-Sequenz und -Dynamik auf das DNA-Kristallselbst

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3112 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die programmierbare Synthese rational konstruierter Kristallarchitekturen zur präzisen Anordnung molekularer Spezies ist ein grundlegendes Ziel der Nanotechnologie, und DNA ist zu einem der wichtigsten Moleküle für den Aufbau dieser Materialien geworden. Insbesondere verzweigte DNA-Verbindungen wurden als zentraler Baustein für den Aufbau von 3D-Gittern verwendet. Hier wird Kristallographie verwendet, um die Wirkung aller 36 immobilen Holliday-Junction-Sequenzen auf selbstorganisierende DNA-Kristalle zu untersuchen. Im Gegensatz zum etablierten Paradigma auf diesem Gebiet ergeben die meisten Verbindungen Kristalle, wobei einige die Auflösung verbessern oder zu einzigartigen Kristallsymmetrien führen. Unerwarteterweise hat sogar die an die Verbindungsstelle angrenzende Sequenz einen erheblichen Einfluss auf die Kristallanordnungen. Sechs der unbeweglichen Verbindungssequenzen sind völlig kristallisationsresistent und gelten daher als „tödlich“. Molekulardynamiksimulationen zeigen, dass diesen Verbindungsstellen ausnahmslos zwei diskrete Ionenbindungsstellen fehlen, die für die Kristallbildung von entscheidender Bedeutung sind. Die hier beschriebenen Strukturen und Dynamiken könnten als Grundlage für künftige Designs sowohl von Kristallen als auch von DNA-Nanostrukturen im weiteren Sinne dienen und potenzielle Auswirkungen auf die Molekulartechnik der angewandten Nanoelektronik, Nanophotonik und Katalyse im kristallinen Kontext haben.

Die Herstellung hochgradig anpassbarer 3D-DNA-basierter Architekturen für die präzise Organisation nanoskaliger Materialien wurde ursprünglich von Seeman im Jahr 19821 konzipiert. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine programmierbare Selbstorganisation ermöglichen, einschließlich der Anbringung von DNA-Linkern an die Nanopartikel ( NP)-Oberflächen2,3 für den Aufbau von 3D-Gittern mit benutzerdefinierten kolloidalen NP-Kristallkonfigurationen4,5,6,7,8. Mit dem Aufkommen von DNA-Origami9 wurden 3D-Übergitter aus Nanopartikel-Clusterformen beschrieben10,11 sowie 3D-Origami-Gitter mit anpassbarer Geometrie, um Gastspezies zu beherbergen12. Es wurde auch gezeigt, dass rational gestaltete Kristalle, die auf dem „Tensegrity“-Motiv13 basieren und sich mit entworfenen vierarmigen Verbindungskreuzungspunkten und „klebrigen Enden“-Kohäsion selbstorganisieren, in Nanogeräte umgewandelt werden können14. Kürzlich wurde über mehrere einzigartige Motive mit ausgeprägten Kristallsymmetrien, verbesserter Auflösung und in einem Fall einer einzigartigen Verbindungsnukleotidsequenz berichtet15,16,17,18.

Die Anwendung von Vier-Wege-Verbindungen für 3D-DNA-Kristalle wurde durch genetische Rekombination inspiriert, bei der ein instabiles verzweigtes Zwischenprodukt namens Holliday Junction (HJ) entsteht und anschließend eine dynamische Rekonfiguration durchläuft, um die Rekombination während der Zellteilung zu erleichtern19. Holliday-Verbindungen wurden umfassend strukturell charakterisiert20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 und erwiesen sich als Schlüsselmotiv für rational gestaltete nanoskalige Anordnungen und Geräte in der strukturellen DNA-Nanotechnologie1,30 Natürlich vorkommende HJs können „ verschieben“ und ändern die Länge ihrer Arme31,32, ein Prozess, der als Zweigmigration33 bekannt ist. Die Einführung asymmetrischer Sequenzen am Verzweigungspunkt führt jedoch zu einer effektiven Immobilisierung der Verbindung und ermöglicht ihre Verwendung beim Aufbau wohldefinierter Nanostrukturen34. Obwohl eine Vielzahl von mehrzweigigen Verbindungen verwendet wurden35,36,37,38,39,40,41 ist die vierarmige HJ nach wie vor die beliebteste.

Theoretisch gibt es 36 Basenpaarkombinationen immobiler Sequenzen. „J1“ wurde am frühesten entworfen42,43 und wurde fast ausschließlich für die Konstruktion von selbstorganisierten 3D-Kristallen13,15,16,17 verwendet, mit einer einzigen Ausnahme, bei der „J10“ verwendet wurde18. Einige frühe Arbeiten untersuchten den Einfluss der Sequenz auf die Packung von gestapelten X-Kontakten mithilfe theoretischer44,45 oder experimenteller Methoden46,47, aber unseres Wissens wurde keine systematische Untersuchung der immobilen HJs durchgeführt. Darüber hinaus ist die Beziehung zwischen der Ionenkonzentration und dem Übergang des HJ von der offenen zur gestapelten Konformation gut bekannt20,25,48,49,50,51; Studien zu Sequenzeffekten auf die Fähigkeit, Ionen zu binden, sind jedoch begrenzt, was die Aufklärung der Strukturparameter, die Kristallisation und Symmetrie beeinflussen, zu einem wünschenswerten Forschungsweg macht.

In dieser Arbeit untersuchen wir eingehend die Fähigkeit aller 36 immobilen HJ-Sequenzen, DNA-Kristalle in zwei unterschiedlich gestalteten Systemen zu bilden. Unsere Arbeit ergab, dass die große Mehrheit der immobilen HJs die Kristallisation ermöglicht, wobei einige Strukturen mit höherer Auflösung und einer Vielzahl von Symmetrien ergeben. Die Symmetrie ist auch sehr empfindlich gegenüber der Reihenfolge der Verbindungsarme (Stämme), die weiter vom Verzweigungspunkt entfernt sind, wie wir anhand von durcheinandergebrachten Stammsequenzen demonstrieren. An zwei konservierten Positionen innerhalb der Strukturen wurden auch einzigartige Ionenbindungsstellen beobachtet. Durch die Durchführung von Molekulardynamiksimulationen (MD) aller 36 HJs in Lösung zeigen wir, dass diese Stellen für die Kristallisation von entscheidender Bedeutung sind, wobei die allgemein nicht kristallisierenden „fatalen“ Verbindungen keinerlei Fähigkeit zeigen, Ionen auf diese Weise zu binden. Obwohl die in dieser Arbeit verwendete Modellierung durch die Probenahme eingeschränkt ist, liefert sie ein zuverlässiges Bild der sequenzabhängigen Flexibilität und Lösungsmitteleffekte aller 36 immobilen HJs in Bezug auf selbstorganisierte DNA-Kristallgitter. Insgesamt bietet die Arbeit eine genaue und vollständige Beschreibung, wie sich verschiedene immobile HJ-Sequenzen, flankierende Sequenzmodifikationen und die Fähigkeit der Verbindung, Ionen einzufangen, tiefgreifend auf das rationale Design selbstorganisierter Systeme auswirken, die eine Vielzahl von Designer-DNA-Architekturen umfassen.

In diesem Bericht werden drei separate selbstorganisierende DNA-Kristallsysteme beschrieben: die Designs „4 × 5“15 und „4 × 6“16 (gemeinsam als 4 × N-Systeme bezeichnet) und ein drittes Konstrukt mit einem „verwürfelten“ Sequenzvariante der 4 × 6-Gitter. Die Selbstorganisation wurde durch drei konstituierende Oligonukleotide vermittelt (Abb. 1a): (S1) enthielt vier Sequenzwiederholungen mit entweder 5 oder 6 Basen; (S2) besteht aus 21 Basen, die zu beiden (S1) komplementäre Regionen enthalten; und (S3), das die zweite Verbindungskreuzung bildet (Abb. 1b). Jede asymmetrische Einheit könnte entweder als HJ mit 10 und 11 bp an jedem Arm oder als linearer Duplex mit 21 bp definiert werden (ergänzende Abbildung 1). Beide Versionen wurden parallel gelöst und ergaben insgesamt 134 Kristallstrukturen (Ergänzungstabelle 1 zur Datenerfassung und Verfeinerungsstatistik). Die Kristallgitter enthalten kontinuierliche Anordnungen, die aus einer Reihe von Kristallblöcken bestehen, die sich selbst zu einer Reihe von 21-bp-Duplexen zusammenfügen, die durch den 4×N-Strang verbunden sind. Der HJ dient als grundlegende Komponente im Kern jeder Einheit, und der endgültige Zusammenbau des vollständigen Gitters wird durch die komplementären klebrigen Enden mit zwei Basen erleichtert, die jeden Duplex abschließen. Die „flankierenden“ Sequenzen im ursprünglichen 4 × 6 wurden auch auf gegenüberliegenden Seiten verändert, um herauszufinden, welche Rolle die Downstream-Sequenz im Kristallisationsverhalten spielen könnte, unabhängig oder in Verbindung mit der HJ-Sequenz selbst.

a Drei Oligonukleotide vermitteln die Kristallisation von zwei selbstassemblierenden Motiven (4 × 5 und 4 × 6) zusammen mit einer „durcheinandergebrachten“ Sequenzvariante. Gezeigt wird ein repräsentatives Beispiel eines 3D-Kristalls. b Die Struktur der Holliday-Verbindung ist der Schlüsselbaustein für den Zusammenbau und enthält vier Arme mit zwei Oligonukleotiden (S1; rot) und (S3; braun), die als Crossover-Stränge dienen, wobei S2 (grün) als dritter „linearer“ Strang dient. komplementärer Strang auf jeder Seite. Die komplementäre Region von S1 enthielt vor jedem Crossover entweder fünf oder sechs Basen (N bp) auf jedem Arm. Zu diesem Zeitpunkt wiederholt sich eine identische Sequenz in jedem aufeinanderfolgenden Arm insgesamt viermal (4×N), bevor die Serie erneut beginnt (4 × 5 oder 4 × 6). S1 dient anschließend als Gerüststrang für das gesamte Gitter. c Der zentrale Baustein, der die 3D-Montage erleichtert. S1 verbindet vier 21-bp-Duplexe mit der Holliday-Verbindung (eingerahmt; durchscheinend) im Kern der Struktur. Das lineare 21-Basen-ssDNA-Oligonukleotid (S2) umfasst eine Hälfte jedes Duplex, wobei der zweite Crossover-Strang (S3) jedes Ende flankiert (eingerahmt). An jedem Duplex befinden sich komplementäre „klebrige Enden“ (Sternchen) von 2 bp, die zusammenhängen, um kontinuierliche 3D-Arrays zu bilden. d Repräsentative Basen, bei denen eine Sequenzasymmetrie eingeführt wurde, um ein „Gleiten“ der Stränge zu verhindern und so 36 immobilisierte Verbindungen zu schaffen. e Drei einzigartige Symmetrien (P3221, P32 und R3) werden durch den 4×N-Gerüststrang bestimmt, der an jeder immobilen Verbindung mit der Sequenz zusammenarbeitet. f Die 36 immobilen Verbindungssequenzen, dargestellt in einem offenen Holliday-Verbindungsformat, wobei jeder Strang gemäß (b) gefärbt ist. Die Nukleotide auf jedem entsprechenden Strang sind mit den Sequenzpositionen auf jedem Oligonukleotidbestandteil entsprechend dem Farbschema in (d) angegeben.

Hier untersuchten wir den Verbindungssequenzraum, indem wir in jedem System eine Gruppe von 36 immobilen HJs (Abb. 1f) erstellten und dabei ein einzelnes festes Isomer betrachteten, um festzustellen, ob andere Verbindungen als J1 kristallisieren und möglicherweise eine verbesserte Auflösung liefern konnten, und um diese zu identifizieren das erwies sich als tödlich. Die Sequenzen wurden explizit für jeden einzelnen Verbindungsstrang definiert (alle Oligonukleotidsequenzen der Komponenten sind in den Zusatzdaten 1 und der Zusatztabelle 2 zu finden) oder wenn sie als 21-bp-Duplex definiert sind (Abb. 1, Zusatzabbildung 2 und Zusatzabbildung). . 3). Um eine Kreuzung definitiv als tödlich zu bestätigen, wurde ein strenges Screening (Ergänzungstabelle 3) durchgeführt, um jede Sequenz abschließend zu klassifizieren (technische Details siehe „Methoden“ in den Zusatzinformationen). Die resultierenden Strukturen enthielten drei verschiedene Symmetrien (P3221, P32 und R3), die im Folgenden ausführlich beschrieben werden (Abb. 1e, ergänzende Abb. 4).

Die ursprüngliche 4 × 5-Struktur mit der J1-Verbindungssequenz führte zu einer strukturell gespannten Anordnung, vermutlich aufgrund der Unterwindung des zentralen Komponentenstrangs . Das geschichtete Motiv lieferte ein wohldefiniertes Gerüst mit einer Auflösung von 3,1 Å, aber die Aperiodizität der Hohlräume und die entsprechenden Volumina wären für das Gerüst von Gastmaterialien unzureichend. Wir stellten die Hypothese auf, dass es möglich sein könnte, andere einzigartige immobile Sequenzen einzuführen, die leichte Störungen im Verbindungswinkel bewirken könnten, um möglicherweise die Spannung im ursprünglichen System zu verringern und ein „entspanntes“ periodisches Gitter zu ergeben.

Das 4 × 5-System kristallisierte robust mit 75 % der Übergänge, und wir erhielten Kristalle in allen bis auf 9 von 36 Sequenzen (ergänzende Abbildung 5 und ergänzende Tabelle 4). Die Verbindungsstellen J2 und J30 kristallisierten zwar, waren jedoch von unzureichender Qualität für die Strukturlösung und wurden daher als tödlich eingestuft. Von den resultierenden Strukturen zeigten 18 P32-Symmetrie mit durchschnittlichen Zellabmessungen a = b = 68,85 Å c = 60,09 Å, wobei nur neun die ursprüngliche P3221-Symmetrie mit durchschnittlichen Zellkanten a = b = 68,17 Å c = 60,60 Å beibehielten (Ergänzungstabelle 5). ). Obwohl die Zellparameter zwischen den beiden Symmetrien praktisch nicht zu unterscheiden waren (Abb. 2a, ergänzende Abb. 6), sind die Unterschiede zwischen der Periodizität der Gitter dramatisch und weisen sehr unterschiedliche Hohlraumgrößen auf (Abb. 2b, c). Während die höchste Auflösung, die für das J1-System erreicht wurde, 3,1 Å betrug, betrug die Auflösung bei etwa der Hälfte der gemessenen Kristalle 3,05 Å oder besser und sogar 2,9 Å (J6) und 2,75 Å (J19) für die P32- und P3221-Symmetrien bzw. (Ergänzungstabelle 6).

a Überlagerte Strukturen der 4 × 5-Übergänge J5 (braun) und J3 (rot) mit P3221- bzw. P32-Symmetrien. Die Verbindungsausrichtung hatte einen globalen RMSD-Wert von 1,34 mit berechneten Interduplexwinkeln von 58,18° bzw. 55,20°. Es sind keine signifikant offensichtlichen optischen Unterschiede erkennbar; Der resultierende globale Einfluss, den selbst ein geringfügiger Winkelunterschied auf die Gesamtpackung haben kann, wird jedoch in (b, c) deutlich. b Schnappschuss des vollständigen J5 P3221 (4 × 5)-Gitters mit einer aperiodischen Anordnung von Hohlräumen, die für den Aufbau von Gastmolekülen nennenswerter Größe nicht geeignet wären. Die beiden Hohlräume unterschiedlicher Größe werden mit schwarzen Kästchen dargestellt. Die Breiten für die jeweilige Kavität sind angegeben. Jeder Hohlraum erstreckt sich über die Länge eines Duplexquerschnitts (~2,0 nm). Alternative Ansichten des Gitters, einschließlich Messungen in jeder Ausrichtung, sind in der ergänzenden Abbildung 8 enthalten. c Schnappschuss des vollständigen J3 P32 (4 × 5)-Gitters, das im Vergleich zu seinem J5-Gegenstück in (b) dramatisch unterschiedliche Anordnungen großer periodischer Hohlräume zeigt. Ein einzelner Hohlraum wird durch eine Blackbox mit einer Breite von 4,0 nm hervorgehoben, die sich auch über die Länge eines Duplexquerschnitts (~2,0 nm) erstreckt. Alternative Ansichten des Gitters einschließlich Messungen in jeder Ausrichtung sind in der ergänzenden Abbildung 8 enthalten.

Die Hohlraumvolumina der P3221-Gitter wurden auf der Grundlage der 3-nm-Kanten der Poren entlang der dreizähligen Symmetrieachse des Kristalls mit einer dreieckigen Prismenhöhe von 6,1 nm berechnet, was der durchschnittlichen c-Achse der Elementarzelle entspricht ( Ergänzende Abbildung 7). Das aperiodische Gitter enthielt Hohlräume mit einer Breite von 1,0 und 1,7 nm in abwechselnden Abständen und ergab äußerst kleine Porenvolumina von ~24 nm3 (Abb. 2b; ergänzende Abb. 7a). Die P32-Kanäle wurden als sechseckiges Prisma mit 6,4 nm entlang jeder Kante und einer Höhe, gemessen von der Oberseite bis zur Unterseite jedes Blocks zusammen mit der durchschnittlichen c-Achse = 6,0 nm, behandelt (ergänzende Abbildung 7b), mit einem resultierenden Volumen von ~639 nm3, eine fast 27-fache Vergrößerung der Hohlraumgröße im Vergleich zu den P3221-Gittern. Die Knoten-PDB-Koordinaten für jeden Symmetrietyp wurden gruppiert und ihre Winkel in DSSR52 analysiert. Die mittleren Winkel über alle Verbindungen innerhalb der Gruppen betrugen 56,05° (σ = 1,63) und 56,59° (σ = 1,50) für P32 bzw. P3221 (Ergänzungstabelle 7). Wir gehen davon aus, dass selbst ein kleiner Unterschied in den Verbindungswinkeln einen signifikanten globalen Effekt auf den Aufbau des Gitters haben könnte, wodurch die Spannung in den P3221-Gittern beseitigt würde.

Parallel dazu verwendeten wir das zuvor beschriebene J1 4 × 6-System (3, 05 Å) mit P32-Symmetrie. Alle 36 Kreuzungssequenzen wurden untersucht und durchweg tödliche Kreuzungen identifiziert. Siebzehn der 36 Verbindungen kristallisierten erfolgreich, was einer Erfolgsquote von 47 % entspricht (ergänzende Abbildung 8 und ergänzende Tabelle 8). Im Gegensatz zum 4 × 5-Motiv zeigten fast alle 4 × 6-Verbindungssequenzen eine starke Präferenz für die Kristallisation in Puffern mit ≥2,0 M Salzen (z. B. LiCl, Li2SO4, KCl und NaCl), wobei die Mehrheit leicht basische pH-Bedingungen bevorzugte in Cacodylsäure (Ergänzungstabelle 9). Bei der Auflösung konnten wir keine nennenswerten Verbesserungen feststellen; In fünf Fällen (J4, 5, 31, 33 und 36) änderte die Verbindung jedoch die Symmetrie von trigonal (P32) zu rhomboedrisch (R3). Darüber hinaus kristallisierten J4 und J36 ausschließlich in R3, J5, 31, 33 zeigten jedoch die Fähigkeit, sowohl in P32 als auch in R3 zu kristallisieren (ergänzende Abbildung 9). In diesen Szenarien bevorzugte R3 niedrige Konzentrationen zweiwertiger Ionen und organischer Lösungsmittel, und P32 erforderte einen hohen Salzgehalt (Ergänzungstabelle 10) mit drastisch unterschiedlichen Gittern (Ergänzungsabbildung 10). Im Vergleich zu den Verbindungen, die im 4 × 5-System keine Kristalle ergaben, erwiesen sich sechs (J11, 12, 13, 17, 18 und 27) Verbindungen durchweg als tödlich (Ergänzungstabelle 11), und wir vermuten, dass diese Sequenzen dies sein könnten als unkluge Optionen für zukünftige Designentscheidungen angesehen.

Die durchschnittlichen Zellkonstanten für die P32-Kristalle betrugen a = b = 68,29 Å, c = 55,68 Å. Insbesondere die c-Achse war ~ 5 Å kürzer und wies einen viel größeren Grad an Variabilität auf (σ = 1, 97) als diejenigen, die unter Verwendung des 4 × 5-Motivs kristallisierten (Ergänzungstabelle 12). Der breite Bereich der kurzen Achse reichte von 52,77 bis 60,36 Å, und wir gehen davon aus, dass die flexiblen Achsenlängen dafür verantwortlich sein könnten, dass eine größere Anzahl von Verbindungen tödlich ist als beim 4 × 5-System. In Kristallen mit R3-Symmetrie betrug die durchschnittliche Zelle für jede Zelle a = b = 114,9 Å c = 49,77 Å, wobei die c-Achse auf einen engeren Bereich beschränkt war (σ = 0,75). Die Hohlraumvolumina unterschieden sich auch deutlich von den Hohlraumvolumina von P32 (~614,7 nm3) im Vergleich zu ~532,1 nm3 in der dichter gepackten R3-Struktur (Berechnungsdetails siehe ergänzende Abbildung 11). Die durchschnittlichen Verbindungswinkel von 54,60° (σ = 1,44) und 58,37° (σ = 2,3) für die P32- bzw. R3-Symmetrien (Ergänzungstabelle 13) sowie ihre Präferenz für Salze oder organische Lösungsmittel waren wahrscheinlich die Hauptfaktoren das ergab die divergenten Gitter.

Da das 4 × 6-System an 5 von 17 Übergängen R3-Symmetrie ergab, überlegten wir, ob die stromabwärts gelegenen Sequenzen neben dem Übergang eine Rolle bei der Kristallisationseffizienz, dem Verbindungswinkel und der Symmetriepräferenz spielen könnten oder ob HJ allein die singuläre Determinante war. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, haben wir „verwürfelte“ Sequenzen mit gezielten Basensubstitutionen (ergänzende Abbildung 12) entworfen, während der GC-Gehalt entlang jedes „Stamms“ beibehalten wurde (Abb. 3a, b). Im Gegensatz zur Pufferpräferenz, die bei den nativen P32-Kristallen beobachtet wurde, zeigten die durcheinandergemischten Systeme eine ausschließliche Präferenz für Puffer mit niedrigem Salzgehalt (Ergänzungsabbildung 13 und Ergänzungstabelle 14), ähnlich wie die nativen R3-Kristalle. Bemerkenswerterweise behielten nur J1 und J2 die P32-Symmetrie bei, während alle anderen ein R3-Gitter ergaben (Ergänzungstabelle 15). Es ist auch bemerkenswert, dass J1 und J2 (P32) zusammen mit den R3-Systemen im Gegensatz zu den ursprünglichen P32-Kristallen auch Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt bevorzugten. Diese Änderung der Pufferpräferenz legt nahe, dass der globale Sequenzinhalt tatsächlich das Selbstassemblierungsverhalten beeinflussen kann. Darüber hinaus beobachteten wir geringfügige Verbesserungen der Auflösung, die in J36 bis zu 2,7 Å erreichten. Bemerkenswerterweise blieben alle Verbindungen, die die Kristallisation im Vergleich zu ihrem ursprünglichen Gegenstück verhinderten, tödlich (Ergänzungstabelle 16) und alle relativen Hohlraumabmessungen und -volumina blieben unverändert (Ergänzungsabbildungen 14 und 15).

eine Stereoansicht einer Überlagerung der J10-Verbindungsstruktur unter Verwendung des ursprünglichen 4 × 6-Sequenzmotivs mit P32-Symmetrie (grau), wobei die verschlüsselte Sequenzversion R3-Symmetrie enthält (blaugrün). Die modifizierten Sequenzen befanden sich innerhalb der beiden stromabwärts gelegenen Stammregionen (1 und 2; angegeben), die den gleichen GC-Gehalt wie die ursprüngliche 4 × 6-Sequenzversion enthielten. Die Auswirkung der verwürfelten Sequenz auf die Geometrie der Verbindungsstelle wird deutlich, wenn man die überlagerten Stammregionen 1 und 2 vergleicht. Der dramatische Unterschied im Verbindungswinkel und sein Einfluss auf die Symmetrie ist offensichtlich (ergänzende Abbildung 15). b Stereoansicht einer Stabdarstellung der überlagerten J10-Strukturen in (a), wobei alle Basenmodifikationsstellen zwischen der ursprünglichen und der verwürfelten Sequenzversion der 4 × 6 J10-Strukturen in den Stämmen 1 und 2 angegeben sind. Sternchen sind eingefügt, um die Aufmerksamkeit darauf zu lenken klebrige Endregionen, die als offensichtliche Folge der durch die modifizierten Stammsequenzen hervorgerufenen Winkel erheblich divergieren. Atome werden wie folgt angezeigt: Kohlenstoff (blaugrün), Stickstoff (blau), Sauerstoff (rot) und Phosphat (orange). Alle Regionen mit identischer Sequenz bleiben durchscheinend.

Die Rolle längerreichweitiger Sequenzeffekte auf Verbindungswinkel bleibt eine weitgehend offene Frage, aber der Effekt in unserem Kristallsystem ist signifikant. Es schien nur einen geringfügigen Unterschied in den durchschnittlichen Zelllängen in den R3-Scramble-Kristallen (a = b = 113,04 c = 51,10; Ergänzungstabelle 17) im Vergleich zu den nativen 4 × 6-Sequenzen (Ergänzungstabelle 12) zu geben: a, b Die Achse war etwa 2 Å kürzer und etwa 1,3 Å länger, wohingegen in den Fällen J1 und J2 die Kristalle gut mit dem ursprünglichen 4 × 6-Motiv übereinstimmten. Die durchschnittlichen Winkel der R3- und P32-Kristalle betrugen 61,00° (σ = 1,21) bzw. 58,05° (σ = 1,39). Obwohl der durchschnittliche Winkel in den R3-Kristallen fast 3° höher ist als der der nativen Sequenz (Ergänzungstabelle 18), wird der verwürfelte Sequenzwinkel aus einer größeren Probengröße berechnet als der kleinere Winkel, der in den nativen 4 × 6-Strukturen berechnet wurde (58,37). °), mit einer deutlich größeren Standardabweichung (2,33). Im Gegensatz dazu betrug der berechnete Winkel für die P32-Kristalle 58,05° (n = 2, σ = 1,39), verglichen mit 54,60° (n = 16, σ = 1,44), einem ungenaueren Durchschnitt aufgrund einer kleinen Probengröße, so wir Gehen Sie davon aus, dass 54,60° den durchschnittlichen beobachteten Winkeln in den 4 × 6-Systemen besser widerspiegelt.

Wir haben zuvor über das Vorhandensein von Arsenionen an zwei gegenüberliegenden Positionen (Pos. 1 und 2, ergänzende Abbildungen 16 und 17) der Verbindung berichtet15, was auf die im Kristallisationspuffer enthaltene Cacodylsäure zurückzuführen ist (Abb. 4). In einer Reihe von Fällen beobachteten wir auch eine Ansammlung von Ionen (Pos3; ergänzende Abbildung 17) innerhalb der kleinen Furche neben Pos2, hatten jedoch keine offensichtlichen Wechselwirkungen mit der Verbindung. Pos1 und 2 waren in den Elektronendichtekarten an einer oder beiden dieser konservierten Stellen in einer erheblichen Anzahl der Strukturen leicht zu erkennen, ohne erkennbaren Bezug auf Motiv oder Symmetrie (Abb. 4). Obwohl in den meisten Fällen die einzelnen Verbindungen, unabhängig von den Designparametern, die Kristallisation in Cacodylsäure im pH-Bereich von 6,0–6,5 bevorzugten, waren nicht alle Kristalle auf diese Anforderung beschränkt. Im 4 × 5-System kristallisierten J25 und J34, beide mit P32-Symmetrie, in 50 mM Tris-Puffer, pH = 8,0, der Kobalthexamin (CoH18N6) und 10 mM MgCl2 enthielt, bzw. 50 mM HEPES, pH = 7,5, mit 20 mM MgCl2. Nur Kobalt konnte für die unterschiedlichen Peaks in den Fo-Fc-Karten in J25 verantwortlich sein, wohingegen in J34 und J22 und J23 in den 4 × 6- bzw. 4 × 6-Scramble-Systemen Mg2+ enthalten war. Die modellierten Ionen waren leicht überlagerbar und an Pos1 und 2 gut koordiniert (ergänzende Abbildung 18).

Stereoskopische Ansicht unter Verwendung von J21 im 4 × 5-System, die 2Fo-Fc-Elektronendichte, die für die Basen in den Kreuzungsbereichen verantwortlich ist, wird bei σ = 2,0 konturiert, und die einzelnen Ionenpositionen 1 und 2 (angezeigt Pos1 und Pos2) werden unabhängig voneinander konturiert die entsprechende Elektronendichte bei σ = 4,0. Das Vorhandensein von Arsen an diesen Stellen wurde nachgewiesen, indem die Kristalle in TAE-Mg2+ (40 mM Tris, 20 mM Acetat und 1 mM EDTA, pH = 8,6) überführt und anschließend eingefroren wurden. Die Kristalle wurden an der Arsen-K-Kante (λ = 1,04 Å) gescannt, wo der entsprechende Arsenat-Peak vorhanden war. Keine anderen Komponenten innerhalb der Kristallisationspuffer konnten für die resultierenden Peaks in den Fo-Fc-Differenzkarten für die Ionen an ihren entsprechenden Stellen verantwortlich sein. Atome werden wie folgt gekennzeichnet: Kohlenstoff (grau), Stickstoff (blau), Sauerstoff (rot), Phosphat (orange) und Arsenionen (grüne Kugeln).

Für alle 36 immobilen HJs wurden vollatomistische MD-Simulationen durchgeführt, um ihre Dynamik in Lösung zu untersuchen und die Eigenschaften der kristallisierenden und nichtkristallisierenden Verbindungen zu vergleichen (ausführliche technische Details finden Sie im Abschnitt „Methoden“ in den Zusatzinformationen). In über 224 μs Simulationen wurde die Kraftfeldleistung als zufriedenstellend erachtet, da in Übereinstimmung mit unseren kristallographischen Experimenten und früheren Studien eine stabile Basenpaarung und helikale B-Form-Topologien beobachtet wurden28,53,54,55. Die Simulationen zeigten relativ geringe Unterschiede in der interhelikalen Dynamik zwischen den 36 immobilen HJs. Wir präsentieren die mittleren Winkelwerte sowie Histogramme der Winkelpopulationen in der Ergänzungstabelle 19 bzw. der Ergänzungsabbildung 18. Der interhelikale Winkel schwankte schnell auf der Mikrosekunden-Zeitskala, was die größere Konformationsfreiheit der HJs in Lösung widerspiegelt. Sein Medianwert war typischerweise niedriger als der, der in den in dieser Arbeit beschriebenen selbstorganisierten DNA-Kristallen beobachtet wurde, was wahrscheinlich einen echten Einfluss der jeweiligen Umgebungen (Kristallgitter vs. freie Lösung) widerspiegelt, da die Simulationswerte besser mit den berichteten übereinstimmen für Röntgenstrukturen isolierter HJs56. Dennoch betrug der Unterschied bei der Mehrzahl der HJs weniger als 5°. Wir stellen fest, dass die ungewöhnlichsten interhelikalen Winkelwerte und -verteilungen für die J11- und J18-Verbindungen beobachtet wurden, die beide nie kristallisierten. Die übermäßige interhelikale Dynamik und Winkelpräferenzen, die mit der Gitterstruktur nicht kompatibel sind, könnten ein Faktor sein, der zur Hemmung des Kristallwachstums für diese beiden spezifischen Verbindungen beiträgt.

Der bedeutendste Unterschied zwischen den einzelnen in MD-Simulationen beobachteten Verbindungen war ihre Fähigkeit, in der Nähe des Verzweigungspunkts der Verbindung unterschiedliche Kaliumionenbindungsstellen zu bilden. In allen Fällen bildete das Ion eine Brücke zwischen dem Phosphat direkt am Verzweigungspunkt und einer oder zwei nächstgelegenen Basen. Diese Stellen stimmten gut mit den Pos1- und Pos2-Stellen überein, die in den experimentellen Kristallstrukturen beobachtet wurden (Abb. 4 und 5a). Da die Basenatome der Verzweigungspunkt-Basenpaare an der Ionenkoordination beteiligt waren, waren die Ionenbindungsstellen zwischen den 36 immobilen HJs sehr unterschiedlich. Der offensichtlichste und auffälligste Unterschied bestand darin, dass die HJs, die in unseren Experimenten nie kristallisierten (J11, 12, 13, 18 und 27), auch diejenigen waren, die in Simulationen durchweg keine Fähigkeit zeigten, diese spezifischen Ionenbindungsstellen zu bilden. J17, das ebenfalls nie kristallisierte, tat dies in einem vernachlässigbaren Anteil (0,02 %) aller Simulationsrahmen (Abb. 5b). Alle anderen HJs kristallisierten in unseren Experimenten und bildeten in unseren Simulationen bis zu einem gewissen Grad diese Ionenbindungsstellen (Abb. 5b). Die mittlere Bindungshäufigkeit in den nicht tödlichen Verbindungen betrug 0,53 (σ = 0,28), was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit, Ionen einzufangen, entscheidend für die Fähigkeit ist, die immobilen HJs zu kristallisieren. Wir spekulieren, dass die Ionenbindungsstelle am Verzweigungspunkt den DNA-Strangaustausch während der Gitterbildung stabilisieren und so das Kristallwachstum erleichtern könnte. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass die Verbindungen, die diese Ionenbindungsstelle nicht oder nur in geringerem Maße bilden können, folglich zu denen gehören, an denen entweder überhaupt keine Kristalle wachsen oder die empfindlicher auf die Kristallisation reagieren Bedingungen. Die einzige Ausnahme bildete J7, das trotz einer entsprechenden Verzweigungspunktsequenz in Simulationen oder Experimenten nicht die Ionenbindungsstelle bildete, aber dennoch kristallisieren konnte.

a Überlagerte Strukturen der 4 × 5 J10-Kristallstruktur (durchscheinendes Grau) mit einem Schnappschuss aus der J10-Simulation in Lösung (braun). Die Arsen-Bindungsstellen (grüne Kugeln) in der Kristallstruktur nahe dem Verzweigungspunkt überlappen mit spontan gebildeten Kalium-Bindungsstellen (blaue Kugeln) in den Lösungsstruktursimulationen. b Diagramme, die das Auftreten von Ioneneinfang in der Nähe des Verzweigungspunkts in Simulationen aller 36 Verbindungssequenzen zeigen. Die übereinstimmenden „fatalen“ Verbindungen (J11, 12, 13, 17, 18 und 27) zeigen keine Fähigkeit zur Ioneneinfangung, mit Ausnahme von J17 (Sternchen), bei dem dies im Vergleich zu den kristallisierenden Verbindungen in vernachlässigbarem Maße der Fall war. Alle anderen Verbindungen, die zu Kristallen führten, zeigten mit nur einem Ausreißer (J7, Raute) die Fähigkeit zum Ioneneinfang in erheblichem Maße. J7 kristallisierte robust, zeigte jedoch weder in Experimenten noch in Simulationen die Fähigkeit, Ionen einzufangen, was darauf hindeutet, dass die Ionenbindung für die Kristallisation dieser einzelnen Verbindung nicht wesentlich ist.

Zunächst könnte ein offensichtlicher Widerspruch im Zusammenhang mit dem experimentell nachgewiesenen Vorhandensein von Arsen aus einem Cacodylat-Anion in der Region bestehen, in der die Simulationen K+-Kationen lokalisieren (Abb. 5). Wir schlagen jedoch vor, dass diese Beobachtungen in Einklang gebracht werden können. Nach unserem Kenntnisstand deuten alle experimentellen Strukturen von HJs in der PDB-Datenbank, die von verschiedenen unabhängigen Gruppen gemeldet wurden, darauf hin, dass Kationen (z. B. Na+, Mg2+, Sr2+, Ba2+) an dieser Stelle binden sollten. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem hier berechneten stark negativen molekularen Wechselwirkungspotential (ergänzende Abbildung 20), das ein Kennzeichen von Kationenbindungsstellen ist. Allerdings passt das Cacodylat-Anion in den meisten hier beschriebenen Kristallstrukturen aufgrund des Vorhandenseins von Natrium-Cacodylat in der Kristallisationslösung tatsächlich am besten in die Elektronendichtekarte unserer Röntgenstrukturen (ergänzende Abbildung 21). Kein anderes Pufferbauteil könnte an dieser Stelle sinnvolle Kontaktabstände mit der Verbindungsstelle selbst bilden. Eine vollständige Beschreibung der umfassenden experimentellen Beweise für dieses Arsen wurde in unserer vorherigen Arbeit beschrieben15. Dieses scheinbar kontraintuitive Ergebnis kann auf verschiedene Weise erklärt werden: Erstens könnte das Cacodylat an dieser Stelle durch Wasserstoffbrückenbindungen und Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel stabilisiert werden, von denen bekannt ist, dass sie selbst in Regionen mit negativen Oberflächenpotentialen für eine Stabilisierung der anionischen Bindung sorgen57,58 . Zweitens könnten an dieser Stelle ein oder mehrere Natriumgegenionen mit Cacodylat assoziiert (verkettet) sein. Es ist bekannt, dass Cacodylat-Anionen auf diese Weise Wechselwirkungen mit negativ geladenen Segmenten von Nukleinsäuren eingehen59,60. Schließlich könnten um das Anion mehrere Na+-Ionen (das Gegenion von Cacodylat) vorhanden sein. Aufgrund der nominellen Auflösung unserer Strukturen, die im Bereich von ~3 Å liegt, ist es nicht möglich, alle interagierenden Spezies eindeutig zu identifizieren, noch ist es möglich, die genaue Koordination, wie z. B. die Beteiligung von Wassermolekülen und Na+, vollständig zu beschreiben . Die Bindung von Na+ könnte die negative Ladung des Cacodylats kompensieren oder sogar überkompensieren und so effektiv die gemeinsame Kationenbindungsstelle wiederherstellen, die in Simulationen und anderen experimentellen Strukturen beobachtet wurde. Die Na+-Ionen schwanken oft und ihre Koordinationsanforderungen sind flexibel, sodass sie für uns völlig unsichtbar sind. Darüber hinaus könnte es, wie Simulationen nahelegen, erhebliche lokale Dynamiken geben, die die Dichten bei der Mittelung verschleiern. Frühere MD-Simulationen ergaben sehr unterschiedliche Na+-Bindungsstellen, von steif bis dynamisch, um Nukleinsäuren61, und es ist durchaus möglich, dass unsichtbare Na+-Kationen das Cacodylat-Anion mit den DNA-Carbonyl- und Phosphatgruppen überbrücken können. Während die Unfähigkeit, die Wechselwirkungsstelle detaillierter zu beschreiben, eine Einschränkung der aktuellen Arbeit darstellt, ist völlig klar, dass die Unterbringung von Ionen an dieser Stelle eine zwingende Voraussetzung für die Stabilisierung und effektive Kristallisation der Verbindung ist.

In dieser Arbeit haben wir über eine systematische Untersuchung aller 36 immobilen HJ-Sequenzen in zwei verschiedenen Kristallsystemen berichtet, Erkenntnisse, die im Prinzip auf jeden 3D-DNA-Kristall und möglicherweise andere Arten von DNA-Architekturen ausgeweitet werden können. Wir zeigen, dass J1 (oder jeder andere Knotenpunkt) nicht als bevorzugte Option für den Entwurf selbstorganisierter Gitter betrachtet werden sollte. Vielmehr sollte eine Vielzahl anderer hier diskutierter Sequenzkombinationen untersucht werden, von denen viele möglicherweise eine überlegene Leistung bieten. Wir machen die wesentliche Beobachtung, dass mehrere Verbindungen – einschließlich J11, 12, 13, 17, 18 und 27 – generell für die Kristallisation tödlich sind und bei zukünftigen Kristalldesigns vermieden werden sollten, es sei denn, alternative Isomere werden in Betracht gezogen. Eine weitere wichtige Beobachtung ist die Bedeutung von Stammregionsequenzen außerhalb des HJ, da diese Sequenz die Kristallsymmetrie und Gitterarchitektur steuern und die Auflösung auf nicht offensichtliche Weise verbessern kann. Wir haben auch die Schlüsselrolle der Ionenkoordination bei der Auslösung dieser Effekte aufgeklärt. Die Skalierung von DNA-Nanostrukturen auf größere Anordnungen – für DNA-Kristalle sowie 1D- und 2D-Gitter und möglicherweise DNA-Origami-Systeme – erfordert wahrscheinlich die Berücksichtigung sequenzabhängiger Effekte sowohl auf der Ebene der Stamm- als auch der HJ-Geometrien. Schließlich können die Winkelverteilungen, die wir aus unseren MD-Untersuchungen von Verbindungen erhalten haben, die Genauigkeit grobkörniger Modelle und DNA-Nanotechnologie-Designtools verbessern, um Nanostrukturen genauer darzustellen.

Zusammenfassend werden unsere experimentellen Ergebnisse durch die bisher größte MD-Simulation (224-μs-Aggregat) bestätigt, die bisher an HJs durchgeführt wurde. Die Simulationen verdeutlichten die Rolle sequenzabhängiger Flexibilität und Lösungsmitteleffekte auf HJ-Konformationen. Diese Arbeit zeigt auch, dass die HJ-Sequenz eine nicht triviale Rolle bei der Bildung von DNA-Kristallen spielt und die Kristallsymmetrie dramatisch beeinflussen kann. Darüber hinaus haben wir eine systematische und umfassende Sequenzstrukturstudie zu selbstorganisierten DNA-Kristallsystemen unter Verwendung aller 36 Verbindungen bereitgestellt. Schließlich enthüllte die Studie unerwartet spezifische molekulare Wechselwirkungen (Ionenbindung) unter Verwendung sowohl experimenteller als auch modellierter Parameter, die in diesem Maßstab noch nie durchgeführt wurden.

Alle Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) gekauft und mittels 14 % denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) oder HPLC gereinigt. Nach der Reinigung wurde die pelletierte DNA in nanoreinem H2O resuspendiert und 5x unter Verwendung von Cut-Off-Filtern mit einem Molekulargewicht von 3 kDa (Amicon) gewaschen, um jegliches verbleibende Salz zu entfernen. Für jedes Konstrukt wurde eine Stammlösung der Dreikomponentenstränge (S1:S2:S3) mit Endkonzentrationen von 30:120:120 µM hergestellt. Die Dampfdiffusionsmethode mit sitzenden Tropfen wurde mit Cryschem-Platten (Hampton Research) unter Verwendung einer Adaption eines eingestellten DNA-Kristallisationsbildschirms eines kommerziellen Anbieters (Sigma Aldrich) durchgeführt, der eine spärliche Matrix mit 48 Bedingungen enthielt (Ergänzungstabelle 3). 500 µL jeder entsprechenden Bedingung wurden zu jedem Reservoir gegeben und ein Gesamttropfenvolumen von 6 µL wurde hergestellt, das eine Mischung aus einem 2:1-Verhältnis von DNA-Stammlösung zur entsprechenden Reservoirlösung mit einer endgültigen Tropfenkonzentration von 30 µM enthielt. Für Verbindungen, bei denen die Kristallisation eine Herausforderung darstellte, wurden mehrere Screening-Runden unter Verwendung des 48-Bedingungen-Sparse-Matrix-Screenings (Ergänzungstabelle 3) durchgeführt, wobei Bedingungen wie DNA-Konzentration, Puffer-pH-Wert, Salzkonzentration und Glühzeiten variiert wurden, um eine zuverlässige Bestimmung zu ermöglichen die Wirksamkeit der Verbindung. Die Platten wurden dann in einen Kühlinkubator (Torrey Pines Scientific, Carlsbad, CA) gestellt und 1 Stunde lang auf 60 °C äquilibriert und dann mit einem linearen Gradienten mit einer Geschwindigkeit von 0,3 °C/h auf 25 °C abgekühlt . Die resultierenden Kristalle wurden mit einem Lichtmikroskop abgebildet (Ergänzende Abbildungen 6, 9, 10) und dann mit einer künstlichen Mutter, die durch direkte Zugabe zum Tropfen mit 30 % Glycerin ergänzt war, kryogeschützt. Die Kristalle wurden anschließend mithilfe von Kryo-Loops (Hampton Research) geerntet und durch sofortiges Eintauchen in ein Bad mit flüssigem Stickstoff kryogekühlt. Alle Daten wurden in einem Stickstoff-Kaltstrom (100 K) an den entsprechenden Strahllinien gesammelt, die in der Ergänzungstabelle 1 angegeben sind.

Alle Beugungsdaten wurden in HKL200062 verarbeitet und die Anfangsphasen wurden unter Verwendung des molekularen Ersatzes in Phaser63 aus der PHENIX64-Programmreihe mit den J1 4 × 5-Strukturen 5KEK und 6X8C als anfänglichen Suchmodellen für die Duplex- bzw. Verbindungsstrukturen berechnet und die J1 4 × 6-Strukturen 5VY6 und 6XNA für die Duplex- und Verbindungsstrukturen mit P32-Symmetrie in diesem System. Mit wenigen Ausnahmen benötigten die meisten 4 × 6 R3-Symmetriekristalle jedoch ein anderes R3-Modell eines ihrer Gegenstücke als ideales Suchmodell. In Coot wurden mehrere Modellbildungsrunden durchgeführt, wobei das ursprüngliche Modell zunächst als einzelner starrer Körper behandelt wurde, gefolgt von nachfolgenden iterativen Runden mit eingeschränkter Verfeinerung in REFMAC65 von CCP466, zusammen mit realem Raum und XYZ-Koordinatenberechnung in phenix.refine. Alle Ionen wurden in Regionen mit Fo-Fc-Differenzdichte mit einem Konturniveau ≥ σ = 3,0 modelliert und verfeinert. Anschließend wurden die Atombelegungen und B-Faktor-Berechnungen verfeinert, zusammen mit einem simulierten Tempern, um die Verfeinerung abzuschließen. Alle verfeinerten Modelle verwendeten einen Rfree-Satz, der 5–10 % der einzigartigen Reflexionen für jede Struktur enthielt. Die Koordinaten und Strukturfaktoren, insgesamt 134 eindeutige Strukturen, wurden in der Proteindatenbank (PDB) hinterlegt, und die entsprechenden Zugangscodes sind in der Ergänzungstabelle 20 aufgeführt. Die Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind alle in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst, die entsprechend unterteilt ist zu ihren jeweiligen Kristallsystemen. Alle in diesem Bericht enthaltenen Haupttexte und ergänzenden Informationsstrukturabbildungen wurden mit PyMOL67 erstellt.

Wir haben die Struktur des in 4 × 5-Gittergeometrie kristallisierten Übergangs J1 (PDB:5KEK)15 als Ausgangsstruktur für alle Simulationen verwendet. Jeder Arm des HJ wurde so verlängert, dass er mindestens acht Basenpaare enthielt, wobei die verlängerten Teile der Helices den benachbarten Zellen des Kristallgitters entnommen wurden. Das resultierende Konstrukt enthielt 64 Nukleotide und wurde als Ausgangsstruktur für Simulationen aller 36 immobilen Verbindungssequenzen verwendet, indem die Basenpaare der Verzweigungspunkte entsprechend ersetzt wurden. Wir haben das xLeap-Modul von AMBER1868 verwendet, um die Topologie- und Koordinatendateien vorzubereiten. In allen gemeldeten Simulationen wurde das neueste AMBER OL15 DNA-Kraftfeld69 verwendet. Während der Überarbeitung haben wir auch das alternative parmbsc1-DNA-Kraftfeld70 für eine Teilmenge der HJs getestet; Mit bsc1 haben wir jedoch eine signifikante Population nicht-nativer und möglicherweise falscher β/γ g + /t-Rückgratkonformationen entdeckt (siehe ergänzende Abbildung 22 und den Begleittext (ergänzende Diskussion 1). Diese Beobachtung steht auch im Einklang mit neueren Berichten71. Wir schlagen daher vor, dass für das vorliegende System das OL15-Kraftfeld die optimale Wahl sein könnte. Jede HJ-Struktur wurde in einem oktaedrischen Kasten aus SPC/E-Wassermolekülen72 mit einem minimalen Abstand von 16 Å zwischen dem gelösten Stoff und dem Kastenrand solvatisiert (ergänzende Abbildung). . 23). Die Salzkonzentration von 0,15 M wurde durch Zugabe von KCl-Ionen ermittelt.73 Die relativen Ionenpositionen wurden dann mit den Ionenstellen in den Kristallstrukturen verglichen. Allerdings sind die MD-Bedingungen und die Beschreibung der Ionenbindung nicht mit den experimentellen Bedingungen identisch , sollten die Simulationen die relativen Gesamtneigungen verschiedener Sequenzen zur Bildung der Ionenbindungsstelle recht realistisch widerspiegeln. Als Nächstes führten wir vor der Produktion eine Äquilibrierung und Minimierung jedes Systems durch. Die erste Minimierung wurde mit einer Positionsbeschränkung von 25 kcal/mol/Å2 auf die DNA durchgeführt, gefolgt von einem Äquilibrierungslauf unter Verwendung derselben Positionsbeschränkung, bei dem das System im Zeitrahmen von 10 ps von 100 auf 300 K erhitzt wurde. Darauf folgte eine Reihe von sechs Minimierungs- und Äquilibrierungsläufen mit 5, 4, 3, 2, 1 und schließlich einer Positionsbeschränkung von 0,5 kcal/mol/Å2 auf die DNA. Jede Minimierung bestand aus 500 Schritten unter Verwendung der Methode des steilsten Abstiegs, gefolgt von 500 Schritten unter Verwendung der Methode des konjugierten Gradienten. Jede Äquilibrierung, mit Ausnahme der ersten, wurde 5 ps lang durchgeführt. Für alle Verbindungen außer J1 wurde zu Beginn ein zusätzlicher Minimierungsschritt durchgeführt, um die anfängliche Geometrie der Verzweigungspunkt-Basenpaare zu optimieren. Produktionssimulationen wurden mit pmemd.cuda74 unter Verwendung periodischer Randbedingungen und des NPT-Ensembles sowie des Standardsimulationsprotokolls75 durchgeführt. Die Länge jeder Simulation betrug 1 μs und es wurden vier unabhängige Simulationen für alle 36 Übergänge durchgeführt. Simulationen ausgewählter HJs wurden dann auf bis zu 20 μs verlängert, um die Konvergenz zu überprüfen (ergänzende Abbildung 24a, b). Die Analysen wurden mit cpptraj und VMD76,77 durchgeführt, wobei das kombinierte Simulationsensemble jeder einzelnen Kreuzung verwendet wurde. Die interhelikalen Winkel der Verbindungen in Simulationen wurden als Jtwist-Parameter gemäß der zuvor von Watson et al.56 beschriebenen Definition gemessen, wobei die beiden Helixachsen der gestapelten Helixarme der Verbindung durch einen Vektor dargestellt und der Jtwist als ihr Punkt berechnet werden Winkelprodukt. Beachten Sie, dass unsere Simulationen Übergänge zwischen rechts- und linksgängigen Kreuzungen abgetastet haben, die jedoch die gleichen Jtwist-Werte aufweisen, die von Watson et al. zugewiesen wurden. Definition von 2004. Um die Händigkeit zu differenzieren, haben wir einen zusätzlichen Vektor senkrecht zum Verzweigungspunkt der Verbindung definiert und ihn dann verwendet, um das Punktwinkelprodukt mit dem Kreuzproduktvektor der beiden Vektoren zu berechnen, die die Helixachsen darstellen. Der Wert dieses zweiten Punktwinkels wurde dann verwendet, um die Händigkeit der Verbindung zu unterscheiden, wobei Werte über und unter 90° jeweils rechts- und linkshändigen Verbindungen entsprachen. Die Jtwist-Werte der linkshändigen Strukturen wurden anschließend um −1 normiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der RCSB-Proteindatenbank unter den folgenden Zugangscodes hinterlegt (4 × 5-Duplex-Strukturen: J1-5KEK, J3-6WQG, J5-6WRB, J6-6X8B, J7-6WSN, J8-6WSO, J9-6WSP, J10-6WSQ, J14-6WSR, J15-6WSS, J16-6WST, J19-6WSU, J20-6WSV, J21-6WSW, J22-6WSX, J23-6WSY, J24-6WSZ, J25- 6WT0, J26-6WRJ, J28-6WRI, J29-6WT1, J31-6WRC; 4 × 5-Verbindungsstrukturen: J1-6X8C, J3-6XDV, J5-6XDW, J6-6XDX, J7-6XDY, J8-6XDZ, J9- 6XEI, J10-6XEJ, J14-6XEK, J15-6XEL, J16-6XEM, J19-6XFC, J20-6XFD, J21-6XFE, J22-6XFF, J23-6XFG, J24-6XFW, J25-6XGM, J26-6XFX, J28-6XFY, J29-6XFZ, J31-6XG0, J32-6XGJ, J33-6XGN, J34-6XGO, J35-6XGK, J36-6XGL; 4×6 Duplexstrukturen mit P32-Symmetrie: J1-5VY6, J2-7JPB, J5 -7JPA, J7-7JPC, J8-7JP9, J10-7JP8, J16-7JP7, J20-7JP6, J22-7JP5, J23-7JON, J24-7JOL, J26-7JOK, J28-7JOJ, J30-7JOI, J31-7JOH , J33-7JOG; 4 × 6-Verbindungsstrukturen mit P32-Symmetrie: J1-6XNA, J2-7JFT, J5-7JFU, J7-7JFV, J8-6XO5, J10-7JFW, J16-7JFX, J20-7JH8, J22-7JH9, J23-7JHA, J24-7JHB, J26-7JHC, J28-6XO6, j30-6XO7, J31-6XO8, J33-6XO9; 4 × 6 Duplexstrukturen mit R3-Symmetrie: J4-7JRY, J5-7JRZ, J31-7JS0, J33-7JS1, J36-7JS2; 4 × 6-Verbindungsstrukturen mit R3-Symmetrie: J4-7JHR, J5-7JHS, J31-7JHT, J33-7JHU, J36-7JHV; 4×6 Scramble-Duplex-Strukturen: J1-7JKD, J2-7JKE, J3-7JKG, J5-7JKH, J7-7JKI, J8-7JKJ, J10-7JKK, J14-7JL9, J16-7JLA, J19-7JLB, J21-7JLC , J22-7JLD, J23-7JLE, J24-7JLF, J26-7JNJ, J30-7JSB, J31-7JSC, J33-7JNK, J34-7JNL, J36-7JNM; 4 × 6 Scramble-Junction-Strukturen: J1-7JK0, J2-7JJZ, J3-7JJY, J5-7JJX, J7-7JJW, J8-7JJ6, J10-7JJ5, J14-7JJ4, J16-7JJ3, J19-7JJ2, J21-7JIQ , J22-7JIP, J23-7JIO, J24-7JIN, J26-7JIM, J30-7JI9, J31-7JI8, J33-7JI7, J34-7JI6, J36-7JI5). Darüber hinaus sind alle entsprechenden Zugangscodes in der Ergänzungstabelle 20 zu finden. Die in dieser Studie generierten Eingabe- und Ausgabedateien für MD-Simulationsdaten wurden in der Zenodo-Datenbank unter dem Zugangscode 6381939 hinterlegt. Die Rohdaten der MD-Simulationstrajektorie sind unter verfügbar Anfrage aufgrund der großen Größe der Datensätze.

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Die in diesem Bericht gezeigten Ergebnisse stammen aus Arbeiten, die an der Argonne Photon Source (APS), der Advanced Light Source (ALS) und der National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) durchgeführt wurden. Das ANL Structural Biology Center (SBC) an der Advanced Photon Source (SBC-CAT) wird von UChicago Argonne, LLC für das US Department of Energy (DOE), Office of Biological and Environmental Research, unter dem Vertrag DE-AC02-06CH11357 betrieben. Das Berkeley Center for Structural Biology wird teilweise vom Howard Hughes Medical Institute unterstützt. Das ALS ist eine Nutzereinrichtung des DOE Office of Science unter der Vertragsnummer DE-AC02-05CH11231. Die ALS-ENABLE-Beamlines werden teilweise vom NIH, National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), gefördert, Zuschuss P30 GM124169. Ergebnisse der Strahllinien AMX (17-ID) und FMX (17-BM) am NSLS-II, einer Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die vom Brookhaven National Laboratory unter der Vertragsnummer DE-SC0012704 für das DOE Office of Science betrieben wird. Die Forschungsressource „Life Science Biomedical Technology Research“ wird hauptsächlich vom NIH, NIGMS durch einen Zuschuss für Biomedical Technology Research Resource P41 (P41GM111244), der National Science Foundation Division of Materials Research (NSF2004250) und vom DOE Office of Biological and Environmental Research (KP1605010) unterstützt ). Diese Arbeit wurde teilweise mit Projekten der SYMBIT reg unterstützt. Nummer CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000477 finanziert durch den EFRE (MK und JS) und 21-23718S durch die Tschechische Wissenschaftsstiftung (MK und JS). NS dankt Startkapital der Arizona State University. HY, NS und PS danken der National Science Foundation Division of Materials Research (NSF2004250) für ihre Unterstützung. HY wurde zusätzlich vom Presidential Strategic Initiative Fund der Arizona State University unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Chad R. Simmons, Tara MacCulloch.

Biodesign Center for Molecular Design and Biomimetics, Arizona State University, 1001S. McAllister Ave, Tempe, AZ, 85287, USA

Chad R. Simmons, Tara MacCulloch, Michael Matthies, Alex Buchberger, Ilyssa Crawford, Petr Šulc, Nicholas Stephanopoulos und Hao Yan

School of Molecular Sciences, Arizona State University, Tempe, AZ, 85287, USA

Tara MacCulloch, Alex Buchberger, Ilyssa Crawford, Petr Šulc, Nicholas Stephanopoulos und Hao Yan

Institut für Biophysik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften, Královopolská 135, 612 65, Brünn, Tschechische Republik

Miroslav Krepl & Jiří Šponer

Regionales Zentrum für fortschrittliche Technologien und Materialien, Tschechisches Institut für fortgeschrittene Technologie und Forschung (CATRIN), Palacky-Universität Olomouc, Slechtitelu 241/27,783 71, Olomouc, Tschechische Republik

Miroslav Krepl & Jiří Šponer

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CRS und HY haben das Projekt konzipiert. TM, AB und IF reinigten die gesamte DNA und bereiteten alle in der Arbeit verwendeten Kristalle unter der Leitung von CRS und NS vor, und CRS führte die gesamte kristallografische Datenanalyse sowie die Strukturlösung und -verfeinerung durch. MK, JS und PS konzipierten alle Molekulardynamik-Simulationsexperimente und die Analyse der Simulationsdaten wurde von MK durchgeführt. Die experimentelle Analyse aller Verbindungswinkel wurde von MM unter der Leitung von PS durchgeführt. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und gaben Manuskript-Feedback , CRS und TM haben alle Zahlen vorbereitet und CRS, MK, NS und HY haben das Papier verfasst.

Korrespondenz mit Nicholas Stephanopoulos oder Hao Yan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Vlasis Mavrantzas und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Simmons, CR, MacCulloch, T., Krepl, M. et al. Der Einfluss der Holliday-Verbindungssequenz und -dynamik auf die Selbstorganisation von DNA-Kristallen. Nat Commun 13, 3112 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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Eingegangen: 27. Oktober 2021

Angenommen: 04. Mai 2022

Veröffentlicht: 03. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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