Kristallstruktur eines hochkonservierten enteroviralen 5′-Kleeblatt-RNA-Replikationselements

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1955 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das äußerste 5′-Ende des Enterovirus-RNA-Genoms enthält eine konservierte kleeblattähnliche Domäne, die 3CD- und PCBP-Proteine ​​rekrutiert, die für die Initiierung der Genomreplikation erforderlich sind. Hier berichten wir über die Kristallstruktur dieser Domäne aus dem CVB3-Genom im Komplex mit einem Antikörper-Chaperon mit einer Auflösung von 1,9 Å. Die RNA faltet sich zu einer antiparallelen Vierwegeverbindung vom H-Typ, die aus vier Subdomänen mit koaxial gestapelten sA-sD- und sB-sC-Helices besteht. Langreichweitige Wechselwirkungen zwischen einem konservierten A40 in der sC-Schleife und einer Py-Py-Helix innerhalb der sD-Subdomäne organisieren nahezu parallele Ausrichtungen der sA-sB- und sC-sD-Helices. Unsere NMR-Studien bestätigen, dass diese weitreichenden Wechselwirkungen in Lösung und ohne Chaperon auftreten. Die phylogenetischen Analysen deuten darauf hin, dass unsere Kristallstruktur eine konservierte Architektur enteroviraler kleeblattähnlicher Domänen einschließlich der A40- und Py-Py-Wechselwirkungen darstellt. Die Proteinbindungsstudien legen außerdem nahe, dass die H-förmige Architektur eine fertige Plattform für die Rekrutierung von 3CD und PCBP2 für die Virusreplikation bietet.

Die Enterovirus-Gattung der Familie Picornaviridae umfasst zahlreiche pathogene Viren, die für viele menschliche Krankheiten wie Erkältung, Poliomyelitis, akute schlaffe Lähmung und Myokarditis verantwortlich sind1,2,3. Diese Viren enthalten ein (+)-sense-einzelsträngiges RNA-Genom mit etwa 7500 Nukleotiden (nts), das am 3′-Ende polyadenyliert und am 5′-Ende kovalent mit dem viralen Protein VPg verknüpft ist (Abb. 1a)4 ,5,6,7. Das gesamte Genom besteht aus einem einzigen offenen Leserahmen (ORF), der von den hochkonservierten 5′- und 3′-untranslatierten Regionen (UTRs) flankiert wird. Die ~750-nt-5′-UTR beherbergt modulare RNA-Domänen, die für die Translation und Replikation des viralen Genoms innerhalb der Wirtszellen essentiell sind (ergänzende Abbildung 1). Ungefähr 660 Nts der 5′-UTR von Position 90 bis 750, die sich unmittelbar stromaufwärts des ORF befinden, tragen zu einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) bei, die die Translation des viralen Genoms durch einen cap-unabhängigen Mechanismus fördert8,9,10,11. Die verbleibenden 90 Nts am äußersten 5′-Ende eines enteroviralen Genoms sind für die Replikation essentiell und es wurde vorgeschlagen, dass sie eine kleeblattähnliche RNA-Sekundärstruktur (5′CL) annehmen, die als Plattform für die Integration erforderlicher viraler und zellulärer Proteinfaktoren dient zur Initiierung der viralen Genomreplikation8,12,13,14,15. Hier berichten wir über eine hochauflösende Kristallstruktur einer intakten enteroviralen Kleeblatt-RNA von einem Mitglied der Enterovirus-B-Spezies – dem Coxsackievirus B3 (CVB3).

ein Schema eines Enterovirus-Genoms, das die Lage des 5′CL und seine vorgeschlagene Sekundärstruktur mit mutmaßlichen Bindungsstellen für virale 3CD- und Wirts-PCBP-Proteine ​​zeigt. b Sekundärstruktur des CVB3 5′CL2a-Kristallisationskonstrukts basierend auf früheren biochemischen Analysen, wobei das Fab BL3-6-Bindungsepitop-5′-GAAACAC-3′-Motiv die L2-Schleife der Subdomäne sB ersetzt. Die grau gefärbten Nukleotide stellen die Mutationen oder Insertionen im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz dar. c Die Kristallstruktur des CVB3 5′CL2a, kokristallisiert mit dem Fab BL3-6 und gelöst mit einer Auflösung von 1,9 Å. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist der Fab in gedrehten Ansichten der RNA-Struktur verdeckt. Abbildungstafeln und entsprechende Beschriftungen sind zum einfachen Vergleich analog gefärbt.

Das 5′CL ist bei allen Mitgliedern der Enterovirus-Gattung hoch konserviert. Aufgrund der hohen Erhaltung der Strukturmerkmale unter enteroviralen 5'CLs wurde gezeigt, dass die chimären enteroviralen Genome mit ausgetauschten 5'CLs lebensfähige Viruspartikel erzeugen16,17,18. Die vorgeschlagene RNA-Sekundärstruktur besteht aus vier hochorganisierten Subdomänen mit den Bezeichnungen sA, sB, sC und sD (Abb. 1a). Die Subdomäne sA bildet den Basisstamm des Kleeblatts, während sich die Subdomänen sB, sC und sD jeweils zu einer eigenen Stamm-Schleifen-Struktur falten. Die Subdomäne sD rekrutiert das virale Fusionsprotein 3CD – einen Vorläufer der viralen Protease 3C und der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) D – durch spezifische Wechselwirkungen der sD-Schleife mit der 3C-Protease17,19,20,21. Die Subdomäne sB mit einer C-reichen Sequenz in ihrer Schleife rekrutiert das Poly(C)-bindende Protein (PCBP) des Wirts, um die Zirkularisierung des viralen Genoms durch Wechselwirkungen mit dem mit der 3 komplexierten Poly(A)-bindenden Protein (PABP) zu erleichtern ′-Ende Poly(A)-Schwanz19,22,23,24,25,26,27,28,29. Eine Stammschleifen-RNA-Domäne, cre, innerhalb der 2C-kodierenden Region des viralen Genoms interagiert auch mit 3CD30,31,32 und fördert die Uridylierung des viralen VPg-Proteins31,33, das anschließend als Primer für das (-) dient. -Strang-RNA-Synthese durch das RdRp D30,34. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Sequenz und die strukturelle Integrität der 5'CLs auch die VPg-Uridylierung und die genomische Stabilität beeinflussen, was mehrere entscheidende Rollen von RNA-Strukturmerkmalen innerhalb der enteroviralen 5'CLs unterstreicht14,35. Trotz des starken Selektionsdrucks verdeutlicht die hohe Konservierung des 5'CL in enteroviralen Genomen auch die viralen Anforderungen zur Erhaltung primärer, sekundärer und tertiärer RNA-Strukturen des 5'CL für Interaktionen mit den vom Virus abgeleiteten Proteinen und Wirtsproteinen während des viralen Genoms Reproduzieren. Allerdings fehlen uns die hochauflösenden dreidimensionalen Strukturen intakter enteroviraler 5′CL, was unser Verständnis dieses grundlegenden virologischen Prozesses einschränkt, der ein enormes Potenzial für die Entwicklung gezielter Therapeutika gegen enterovirale Infektionen birgt.

Mehrere biochemische und biophysikalische Methoden wurden verwendet, um die Strukturen enteroviraler 5′CL-Subdomänen und ihre molekularen Wechselwirkungen mit PCBP und 3C- oder 3CD-Proteinen zu untersuchen36,37,38,39,40,41,42,43,44. Frühere Studien konzentrierten sich auf das Verständnis isolierter sD-Strukturen mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), einschließlich der NMR-basierten Strukturen von sD-Subdomänen von CVB3, Rhinovirus B14 (RVB14) und einer enteroviralen Konsensussequenz36,37,38,40,43. In Übereinstimmung mit der chemischen Untersuchung und den SHAPE-Analysen (selektive 2′-Hydroxylacylierung, analysiert durch Primerverlängerung) im Zusammenhang mit den 5′CLs voller Länge oder den gesamten 5′-UTRs39,42,45 zeigten die NMR-Strukturen eine gut konservierte Struktur Struktur der sD-Varianten, die eine haarnadelartige Architektur mit einem A-förmigen helikalen Stamm annimmt, der von einer Tetraloop bedeckt ist. Interessanterweise zeigten die Strukturen auch eine einzigartige Pyrimidin-Pyrimidin (Py-Py)-Basenpaarregion innerhalb des sD-Stamms, von der zuvor vorhergesagt wurde, dass sie eine symmetrische 3 × 3-nt-Ausbuchtung bildet. Die Sequenz und die Struktur dieser Region sind bei allen Enteroviren gut konserviert, und wie zuvor für CVB3 gezeigt, verringert die Deletion eines Nukleotids, nicht jedoch die kompensatorische Punktmutation, in dieser Region die sD-Wechselwirkungen mit der 3C-Protease, was darauf hindeutet, dass die Die Integrität der in der Py-Py-Region gebildeten Strukturmerkmale ist wichtig für die 3C-Bindung14,20. Die NMR-Daten stützten jedoch nicht die direkten Wechselwirkungen zwischen dieser Region und der 3C-Protease. Die direkten Wechselwirkungen mit dem Protein betrafen nur die sD-Loop-Nukleotide und zwei GC-Basenpaare, die die Py-Py-Region flankieren38. Später haben Warden et al. berichteten über eine NMR-Struktur einer isolierten 24-nt-sB-Sequenz aus RVB14, die sich zu einer Haarnadel mit einem überwiegend A-förmigen helikalen Stamm faltet, der von einer ungeordneten 8-nt-Schleife abgedeckt ist41. Die C-reiche Region innerhalb der Schleife, die Erkennungsstelle für das Wirts-PCPB, wurde dem Lösungsmittel ausgesetzt, was mit früheren biochemischen Studien übereinstimmt41. Die Stammregion wies eine zugängliche Hauptfurche auf, was auf einen möglichen Ort für Proteininteraktionen hinweist. Zuletzt haben Warden et al. leiteten die Strukturmodelle des RVB14 5′CL in voller Länge mithilfe von NMR- und Kleinwinkel-Röntgenstreuungstechniken (SAXS) ab43. Die vorgeschlagenen Strukturmodelle nahmen zwei Konformationen an, abhängig von der Anwesenheit und Abwesenheit von Mg2+ in der Lösung. In Abwesenheit von Mg2+ nahm das 5′CL eine ausgedehnte Konformation an, die einer Vier-Wege-Verbindungsstruktur vom cK-Typ ähnelte, wobei die sB- und sD-Subdomänen nahezu senkrecht zueinander standen, wohingegen es in Gegenwart von Mg2+ eine kompaktere Konformation annahm Konformation, die diese sB- und sD-Subdomänen gegenüberstellt43. Ohne die hochauflösenden Strukturen anderer Subdomänen (sA und sC) und ein intaktes 5′CL sind jedoch die topologischen Anordnungen der 5′CL-Subdomänen und die Strukturmerkmale, die ihre Bindungsinteraktionen mit dem viralen 3C, 3CD und dem Wirt erleichtern, nicht möglich PCPB-Proteine ​​sind noch weitgehend unbekannt.

Hier verwenden wir ein synthetisches Antikörperfragment (Fab) als Chaperon, um die Kristallstruktur des 5′CL voller Länge aus CVB3 mit einer Auflösung von 1,9 Å zu kristallisieren und zu bestimmen. Die RNA faltet sich zu einer Vier-Wege-Verbindungsarchitektur vom H-Typ ohne ungepaarte Nukleotide innerhalb der Verbindung. Die Unterdomänen bilden zwei Sätze koaxial gestapelter Helices, wobei jede koaxiale Stapelung nahezu eine kontinuierliche A-förmige Helix bildet. Innerhalb der Vier-Wege-Verbindung stapelt sich die sA-Helix auf der sD-Helix und die sB-Helix auf der sC-Helix. Die vom Kristall abgeleitete Sekundärstruktur stimmt gut mit denen überein, die zuvor aus biochemischen Untersuchungen, SHAPE und den NMR-Untersuchungen isolierter Subdomänen verschiedener 5′CLs abgeleitet wurden. Überraschenderweise zeigte unsere Kristallstruktur eine beispiellose tertiäre Wechselwirkung zwischen der hochkonservierten sB-Schleife und der sD-Helix-Py-Py-Region. Diese Wechselwirkungen stimmen gut mit unseren Lösungs-NMR-Ergebnissen überein, was darauf hindeutet, dass die in unserer Kristallstruktur beobachteten Strukturmerkmale denen in der Lösung entsprechen. Die einzigartige Anordnung dieser Strukturmerkmale legt auch nahe, dass sie wichtig für die Stabilisierung der Gesamtstruktur des 5′CL sind, das seine sB- und sD-Subdomänen perfekt für Wechselwirkungen mit 3C- oder 3CD- und PCBP-Proteinen positioniert, was mit unseren Bindungsstudien unter Verwendung von rekombinantem CVB3 übereinstimmt 3C-Protease und menschliches PCBP2 mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) und Gelelektrophorese. Unsere hochauflösende Strukturbestimmung eines intakten 5'CL aus einem Enterovirus wird die Bemühungen erleichtern, die strukturelle Organisation und die funktionellen Rollen des 5'CL während der enteroviralen Genomreplikation zu verstehen. Darüber hinaus wird diese Studie angesichts eines hohen Grades an Sequenz- und Sekundärstrukturkonservierung von 5'CLs bei Enteroviren zum Verständnis des 5'CL-vermittelten enteroviralen Replikationsmechanismus beitragen, der ein enormes Potenzial für die Entwicklung gezielter Therapeutika zur Hemmung der Virusreplikation bietet und möglicherweise führend ist zu einer wirksameren Behandlung vieler menschlicher Krankheiten, die durch enterovirale Infektionen verursacht werden.

Die CVB3 5'-UTR enthält sieben modulare Domänen, die hochorganisierte RNA-Sekundärstrukturen umfassen (ergänzende Abbildung 1) . Die mit II bis VII bezeichneten Domänen umfassen die IRES-Elemente, die über einen cap-unabhängigen Mechanismus für die Translation des viralen Genoms verantwortlich sind, während Domäne I die 5′CL-Struktur darstellt8,9,10,11,12,13,14,15. Das 90-nt-Wildtyp-Kristallisationskonstrukt (WT) aus CVB3-Isolat 28 umfasst das gesamte 5'CL (nts 2 bis 88) mit zwei zusätzlichen GC-Paaren am Anfang der sA-Helix (ergänzende Abbildung 2). Unsere Bemühungen, dieses WT-5′CL-Konstrukt zu kristallisieren, waren erfolglos; Daher folgten wir einer Chaperon-unterstützten RNA-Kristallisationsstrategie. Wir haben Fab-Fragmente als Chaperone für die Kristallisation des Fab-RNA-Komplexes und als molekulare Ersatzmodelle für die anfängliche Phaseneinstellung während des Strukturbestimmungsprozesses entwickelt und eingesetzt46,47,48,49,50,51. Einer der Ansätze dieser Strategie nutzt ein Fab-Epitop-Modul, bei dem das RNA-Epitop in die Ziel-RNA gepfropft wird, um dessen Komplexbildung mit dem Fab zu ermöglichen, was die anschließende Kristallisation des Fab-RNA-Komplexes46,47,48,49,50 ermöglicht ,51. Fab BL3-6 war unter anderem ein sehr effektives Chaperon zur Kristallisierung und Bestimmung der hochauflösenden Kristallstrukturen mehrerer RNA-Ziele46,47,49,50,52,53. Das Fab bindet an eine Haarnadel-RNA mit einer 5′-AAACA-3′-Pentaloop-Sequenz, die vorzugsweise durch ein GC-Paar geschlossen wird, was ein einfaches Engineering der Epitopsequenz in die Ziel-RNA46,47,49,50,52,53 ermöglicht.

Basierend auf den mutmaßlichen Sekundärstrukturen des 5'CL, die aus biochemischen Untersuchungen, SHAPE- und NMR-Studien an intaktem 5'CL und seinen isolierten Domänen abgeleitet wurden, haben wir drei separate RNA-Konstrukte hergestellt: 5'CL2, 5'CL3 und 5'CL4 , zur Kristallisation durch Ersetzen der L2-, L3- und L4-Schleifen des WT 5'CL durch die 5'-GAAACAC-3'-Sequenz, um eine Bindungsstelle für den Fab BL3-6 in jedem RNA-Konstrukt zu schaffen (ergänzende Abbildung 2) . Die nativen Polyacrylamid-Gelelektrophoresetests bestätigen, dass Fab BL3-6 explizit an diese drei RNA-Konstrukte bindet (ergänzende Abbildung 3), was mit früheren Berichten für andere RNA-Konstrukte übereinstimmt, die mit dieser Fab BL3-6-Bindungssequenz gepfropft sind. Da Fab BL3-6 nur als Haarnadel-RNA an seine Epitopsequenz bindet, deuten diese Beobachtungen auch darauf hin, dass jede 5′CL-Subdomäne, sB, sC und sD, wahrscheinlich unterschiedliche Stamm-Schleifen-Strukturen annimmt, was mit früheren biochemischen und NMR-Studien übereinstimmt.

Im Anschluss an die Bindungstests führten wir die Kristallisationsversuche für alle drei RNA-Konstrukte, 5′CL2, 5′CL3 und 5′CL4, im Komplex mit Fab BL3-6 durch. Wir beobachteten Kristalle für die 5′CL2- und 5′CL4-Komplexe, jedoch nicht für den 5′CL3-Komplex. Von den 480 Bedingungen, die für jeden Komplex untersucht wurden, kristallisierte der 5′CL2-Komplex unter weniger Bedingungen (2) als 5′CL4 (16). Die analogen Versuche für beide Konstrukte ohne Fab BL3-6 ergaben keine Kristalle, was auf eine wesentliche Rolle des Fab bei der Erleichterung der 5'CL2- und 5'CL4-Kristallisation schließen lässt. Leider erreichten die Kristalle dieser Komplexe nur eine Auflösung von ~8 Å, was für eine hochauflösende Strukturbestimmung unzureichend war. Um Kristalle von besserer Qualität und einen hochauflösenden Beugungsdatensatz zu erhalten, haben wir mehrere 5′CL2-Mutantenkonstrukte vorbereitet, um die Kristallisationsversuche im Komplex mit Fab BL3-6 durchzuführen. Für jede L2-Loop-Mutante haben wir die sD-Haarnadelmodelle mithilfe von ROSIE54,55 vorhergesagt, mit besonderem Augenmerk auf die L2-Tetraloop-Konformation. Die Modelle sagen voraus, dass der G66C-Mutant eine Tetraloop-Konformation vom GNRA-Typ annimmt, verglichen mit einer Tetraloop vom UNCG-Typ für den Wildtyp-L2 (ergänzende Abbildung 4). Da bekannt ist, dass die Tetraloops vom GNRA-Typ Kristallkontakte erleichtern, verwendeten wir diese G66C-Mutation im Zusammenhang mit 5'CL2 mit der Bezeichnung 5'CL2a (Abb. 1b), was robuste Kristalle im Komplex mit dem Fab ergab, der auf 1,9 beugte Ein Beschluss. Für den anschließenden Strukturlösungsprozess mit diesen Daten verwendeten wir eine frühere Kristallstruktur von Fab BL3-6 (PDB-Code: 6B14)46 als molekulares Ersatzmodell und erhielten problemlos die Anfangsphasen. Nach der anfänglichen Phaseneinteilung ermöglichte uns die hochauflösende Elektronendichtekarte eine eindeutige Modellierung der RNA-Nukleotide. Die Struktur wurde dann durch iterative Runden der Modellneubildung und -verfeinerung bei einer Auflösung von 1,9 Å gelöst, und das endgültige Modell des 5′CL2a-BL3-6-Komplexes konvergierte mit Rwork = 20,9 % und Rfree = 25,9 %. Die Details zur Datenerfassung und Verfeinerungsstatistik sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Das endgültige Strukturmodell des 5′CL2a-BL3-6-Komplexes mit dem 2|Fo | -|Fc | Die Elektronendichtekarte und die entsprechend den kristallographischen B-Faktoren gefärbte Karte sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 5 bzw. 6.

Die kristallographische asymmetrische Einheit (a = 122,20, b = 48,70, c = 144,65, ɑ = 90, β = 112,92 und γ = 90) mit einer Gitterraumgruppe C 1 2 1 enthält einen einzelnen Fab-RNA-Komplex. Die Analyse der Grenzflächenfläche innerhalb der Elementarzelle mit PDBePISA57 ergab, dass einschließlich der Fab-RNA-Bindungsschnittstelle die Fab-Fab-, Fab-RNA- und RNA-RNA-Kristallkontakte eine Fläche von ca. 142, 2993 bzw. 266 Å2 ausmachen. Während Fab den Großteil der Kristallkontakte herstellt (~92 % einschließlich der Fab-RNA-Bindungsschnittstelle), machen die RNA-RNA-Wechselwirkungen durch koaxiale Stapelung symmetriebezogener sA-Helices innerhalb des Kristallgitters (ergänzende Abbildung 7) etwa 8 % aus des Grenzflächenbereichs. Bei den Fab-RNA-Kontakten im Kristallgitter außer der Bindungsschnittstelle handelt es sich hauptsächlich um elektrostatische Wechselwirkungen der

RNA-Rückgrat mit Lysin- und Arginin-Seitenketten aus den schweren und leichten Ketten der symmetriebezogenen Fabs, was darauf hinweist, dass Fab die Kristallpackung erleichtert, indem es die negativen Ladungen auf der RNA-Oberfläche neutralisiert (Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung 8).

Die Kristallstruktur des 90-Nukleotid-5'CL2a-Konstrukts geht von einer kompakten antiparallelen Vier-Wege-Verbindungsarchitektur vom H-Typ aus, die aus einem Stamm und drei Stamm-Schleifen-Regionen besteht (Abb. 1c). Die vier Helixstämme, aus denen die mit P1, P2, P3 und P4 bezeichnete Vierwegeverbindung besteht, bilden zwei Sätze koaxial gestapelter Helices, wobei P1 auf P4 und P2 auf P3 stapelt. Innerhalb der Vier-Wege-Verbindung, ohne ungepaarte Nukleotide und mit perfekter Kreuzstrangstapelung der P1-Helix G10 mit der P4-Helix G47 und der P2-Helix C11 mit der P3-Helix C46, ​​bildet jeder Satz dieser koaxialen Stapelung nahezu eine kontinuierliche A-förmige Helix. Wie erwartet schließt die L2-Schleife die P2-Helix und bindet Fab BL3-6, was mit den Fab-Schleifen-Wechselwirkungen übereinstimmt, die für andere RNA-BL3-6-Komplexkristallstrukturen beobachtet wurden46,47,49,50,52,53. In ähnlicher Weise schließen eine Trinukleotidschleife L3 und eine Tetranukleotidschleife L4 die P3- bzw. P4-Helices. Eine Dinukleotid-Ausbuchtung mit U49 und A50 trennt die Helix P4 in die Unterhelices P4a und P4b, wobei U49 innerhalb des kontinuierlichen Helixstapels verbleibt und A50 aus der Helix herausklappt, um mit einem symmetrischen Fab-Molekül im Kristallgitter zu interagieren ( Ergänzende Abbildung 8). Die P4b-Helix enthält eine Py-Py-Region mit einem U·U-Basenpaar auf beiden Seiten des zentralen C·U-Basenpaars.

Die vom Kristall abgeleitete Sekundärstruktur von 5'CL2a (Abb. 2a) in Form von basengepaarten Helices (P1, P2, P3 und P4), Dinukleotid-Ausbuchtung, Py-Py-basengepaarter Region und Schleifen (L2, ( 2-Morpholinoethylcarbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (CMCT) und Ketoxal (Abb. 1b, Einzelheiten siehe ergänzende Abb. 9)39,42,45. Darüber hinaus sind die Strukturen der gesamten sD-Subdomäne und der sB-Helix nahezu identisch mit denen, die zuvor isoliert durch Lösungs-NMR-Ansätze bestimmt wurden (ergänzende Abbildung 9), 37, 38, 40, 43, was darauf hindeutet, dass unsere 5'CL2a-Kristallstruktur diese darstellt Lösungskonformation.

a Die vom Kristall abgeleitete Sekundärstruktur des CVB3 5′CL2a-Konstrukts. Die gepunktete Linie zeigt tertiäre Wechselwirkungen zwischen der L3-Schleife A40 und der P4-Helix-Py-Py-Region. b Die tertiären Wechselwirkungen zwischen den sA- und sB-Subdomänen. c Struktur der Trinukleotidschleife innerhalb der sC-Subdomäne. d Überlagerung der 5′-ccAUUgg-3′- und 5′-ccUCUgg-3′-Stammschleifen (RMSD = 0,44 Å) aus den Kristallstrukturen von CVB3 5′CL2a (rote Triloop mit violettem Stamm) und Agrobacterium tRNALeu (gelb). , PDB-Code: 5AH5)60. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur die Schleifennukleotide im Detail dargestellt. e Struktur der Dinukleotid-Ausbuchtung innerhalb der P4-Helix der sD-Subdomäne. Schwarze gestrichelte Linien und rote Kugeln in (b) und (e) spiegeln Heteroatome innerhalb von Wasserstoffbrückenbindungsabständen bzw. Wassermoleküle wider. Das graue Netz stellt das 2|Fo | dar -|Fc | Elektronendichtekarte auf Konturebene 1σ und Schnitzradius 1,8 Å.

In der Kristallstruktur von 5′CL2a bilden die ersten zehn Nukleotide (G1–G10, 5′-Ende) kanonische Watson-Crick-Basenpaare, wobei die letzten zehn Nukleotide (C81–C90, 3′-Ende) das P1 bilden Helix, die die gesamte sA-Subdomäne darstellt (Abb. 2a, b). Innerhalb der P1-P2-Verbindung kommt es zu einer scharfen Kurve zwischen G10 und C11, wodurch die gesamte P2-Helix gebogen wird, um sie nahezu parallel zur P1-Helix zu positionieren (Abb. 2a, b). Die P2-Helix wird dann durch die Schleife L2 – die Bindungsstelle für Fab BL3-6 – abgedeckt, wodurch die vollständige sB-Subdomänenstruktur entsteht (Abb. 2a, b). Im WT 5'CL wird erwartet, dass die L2-Schleife ein acht Nukleotide umfassendes C-reiches Motiv bildet, das die Bindungsstelle für das PCBP darstellt (ergänzende Abbildung 2). Mit Ausnahme des abschließenden G20-C26-Basenpaars des BL3-6-Bindungsmotivs besteht die P2-Helix aus neun Watson-Crick-Basenpaaren und bildet eine typische A-Form-Helix (Abb. 2b), die mit der vorherigen übereinstimmt biochemische Untersuchungen und die NMR-Modelle der RVB14-sB-Subdomäne41, was darauf hindeutet, dass diese sB-Helixstruktur bei Enteroviren gut konserviert ist. Darüber hinaus beobachteten wir tertiäre Kontakte zwischen den Grundgerüsten der P1- und P2-Helices durch direkte und durch Wasser vermittelte Wasserstoffbrückenbindungen, wodurch die gesamten Nebeneinanderpositionen von sA und sB stabilisiert wurden (Abb. 2b). Insbesondere bildet G83 2′-OH eine direkte Wasserstoffbindung mit dem Phosphatsauerstoff des C29-Grundgerüsts. Dennoch beobachteten wir keine signifikante Abweichung der P2-Helix von einer typischen A-Form-Helix, einschließlich einer Verbreiterung der Hauptfurche, wie zuvor basierend auf den NMR-Strukturen der sB-Subdomäne von RVB1441 vorgeschlagen. Obwohl es möglich ist, dass die Unterschiede in den Hauptfurchenbreiten für die CVB3- und RVB14-sB-Helix die Unterschiede in den für diese RNA-Strukturbestimmung verwendeten Methoden widerspiegeln, sind die strukturellen Unterschiede zwischen unseren CVB3- und RVB14-sB-Helices wahrscheinlich auf die unterschiedliche Anzahl von Basenpaaren zurückzuführen flankiert die 4-Wege-Verbindung, die die sB-Helix bildet (ergänzende Abbildung 10). Die sB-Helix mit neun Basenpaaren in der CBV3-sB-Subdomäne bildet eine nahezu vollständige Helixwindung, verglichen mit einer etwas mehr als einer halben Helixwindung, die von der sB-Helix mit sieben Basenpaaren in der RVB14 gebildet wird. Darüber hinaus enthält die RVB14-sB-Helix im Vergleich zu allen kanonischen Basenpaaren im CVB3-sB ein nicht-kanonisches G·U-Paar (ergänzende Abbildung 10).

Die vier kanonischen Watson-Crick-Basenpaare mit den Nukleotiden G36–C39 und G43–C46 bilden die P3-Helix (Abb. 2a). Innerhalb der P2-P3-Verbindung stapelt sich G36-C46 der P3-Helix koaxial auf G34-C11 der P2-Helix und bildet nahezu eine kontinuierliche A-förmige Helix (Abb. 1c, 2a). Eine Trinukleotidschleife L3 mit der 5′-AUU-3′-Sequenz schließt die P3-Helix, was mit den vorherigen biochemischen Sondierungs- und SHAPE-Ergebnissen übereinstimmt39,42,45. Innerhalb der Schleife (Abb. 2c) projiziert eine scharfe Wende in der Helix zwischen C39 und U41 das Nukleotid A40 weit aus der Helixachse heraus und ermöglicht so seine tertiären Wechselwirkungen mit der P4-Helix. Das Nukleotid U41 mit C2′-endosyn-glykosidischer Konformation stapelt sich auf dem schleifenschließenden Basenpaar C39-G43, wodurch es für Modifikationen weniger zugänglich ist. Die zweite scharfe Kurve zwischen U41 und G43 dreht das Nukleotid U42 aus der Helixachse und stellt möglicherweise Kristallkontakte mit einem symmetrischen Fab im Kristallgitter her. Dennoch deutet die geringe Elektronendichte, die für die Nukleobase U42 mit einem hohen B-Faktor beobachtet wurde, auf ihre hochdynamische Natur hin. Diese für diesen Triloop beobachteten Strukturmerkmale stimmen mit den Ergebnissen früherer biochemischer Untersuchungen in der Lösung überein, dass die U41- und U42-Nukleobasen in diesem Triloop mäßig bzw. stark anfällig für Modifikationen durch CMCT39,45 waren. Obwohl Triloops in RNA-Strukturen seltener vorkommen als Tetraloops, ergab die Suche nach diesem Triloop-Motiv in zuvor beschriebenen RNA-Strukturen mithilfe der RNA-CoSSMos-Datenbank59 keinen Treffer für eine exakte 5′-AUU-3′-Sequenz in den Triloops. Die Struktur dieser 5′-ccAUUgg-3′-Triloop konnte jedoch mit einer 5′-ccUCUgg-3′-Triloop (Abb. 2d, RMSD = 0,44 Å) überlagert werden, die zuvor in der Kristallstruktur von Agrobacterium tRNALeu (PDB-Code: 5AH5) beobachtet wurde )60, was darauf hindeutet, dass diese Triloops eine eigene Klasse von RNA-Motiven darstellen.

Die C46- und G47-Nukleotide machen innerhalb der P3-P4-Verbindung eine scharfe Kurve und biegen die gesamte P4-Helix, wodurch sie nahezu parallel zur P3-Helix positioniert wird und eine koaxiale Stapelung mit der P1-Helix ermöglicht (Abb. 1c, 2a). Neben der Verbindung bilden die Basenpaare G47 und C48 mit C80 bzw. G79 die P4a-Helix. Ein asymmetrisches Dinukleotidhorn mit U49 und A50 trennt die P4a- von der P4b-Helix, wobei U49 innerhalb des Helixstapels verbleibt und an der Basendreifachbildung U49·G51-C78 beteiligt ist (Abb. 2a, e). Während G51 und C78 Watson-Crick-Basenpaare bilden, interagieren U49 und G51 über die Watson-Crick- und Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung. Darüber hinaus geht U49 O4 eine Wasserstoffbrücke mit der Aminogruppe C78 ein. Das Nukleotid A50 springt aus der Helix und interagiert mit einem symmetrischen Fab-Molekül im Kristallgitter, was möglicherweise für die Kristallisation entscheidend ist (ergänzende Abbildung 8). Außerdem befindet sich das 2′OH des A50 innerhalb des Wasserstoffbrückenbindungsabstands seines N3 und des G51 O4′. In Übereinstimmung mit der hohen Konservierung der Bulge-Nukleotide scheinen diese Strukturmerkmale für die Stabilität der sD-Helix wesentlich zu sein. Während die Kristallstruktur möglicherweise eine abgetastete Konformation der Ausbuchtung mit ausgeklapptem A50 darstellt, die durch den Kristallkontakt stabilisiert wird, stützt ein starkes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk innerhalb der Ausbuchtung eher eine stabile als eine dynamische Konfiguration dieser Ausbuchtung. Außerdem ist das 49. Nukleotid im Vergleich zu A50 bei enteroviralen 5‘CLs weniger konserviert, was darauf hindeutet, dass ausgeklapptes A50 für Interaktionen mit den 5‘CL-Bindungsproteinen wichtig sein könnte. Die Ausbuchtung trägt möglicherweise dazu bei, eine korrekte Positionierung der Py-Py-Region für tertiäre Wechselwirkungen mit der sC-Schleife beizubehalten, ohne die Helixachse der sD-Subdomäne zu stören. Nach der Ausbuchtung bilden die Nukleotide C52–A61 Watson-Crick-Basenpaare mit U68–G77, einschließlich der hochkonservierten Py-Py-Basenpaare. In der Py-Py-Region bilden die Nukleotide U55, C56 und U57 Basenpaare mit U74, U73 und U72 über nichtkanonische Watson-Crick-Wasserstoffbrücken (Abb. 3a). Interessanterweise ist die Py-Py-Doppelhelix etwas schmaler (Phosphat-zu-Phosphat-Durchmesser = 16,8 ± 0,3 Å, Abb. 3b) im Vergleich zu den Doppelhelices, die die Region flankieren (Phosphat-zu-Phosphat-Durchmesser = 18,6 ± 0,6 Å, Abb. 3b). Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen in NMR-Modellen von CVB3- und RVB14-sDs36,37,38,40,43. Diese ungewöhnlichen aufeinanderfolgenden Py-Py-Basenpaarungen (U55·U74, C56·U73 und U57·U72) erzeugten jedoch keine signifikante Verformung innerhalb des P4 gegenüber einer Standard-A-Form-Helix oder veränderten die relativen Positionen der Helixenden (siehe Ergänzende Abbildung 11 für Einzelheiten). Schließlich bedeckt die Schleife L4 mit einem Wobble U62·G67 schließenden Basenpaar, das eine wohldefinierte Tetraloop-Struktur annimmt (Abb. 1c, 2a), die P4-Helix.

a Die Kristallstruktur der Py-Py-Basenpaare innerhalb der P4-Helix von CVB3 5′CL2a. b Der Phosphat-zu-Phosphat-Abstand zwischen den Basenpaaren entlang der P4-Helix. c Überlagerung der sD-Kristallstruktur der CVB3 5′CL2a-Subdomäne (cyan) mit zuvor berichteten NMR-Strukturen der sD-Subdomänen für CVB3 5′CL (blau) und einer enteroviralen Konsensussequenz (magenta). d Überlagerung nur der Py-Py-Region für die drei Strukturen, wie in (c) beschrieben. e Die Hauptrillenbreite innerhalb der P4-Helix. Die gestrichelten schwarzen Linien zeigen die Abstände zwischen Pi und Pi+6 entlang der Helix. f Die im Kristallisations-5′CL2a-Konstrukt beobachtete Tetraloop-Struktur vom GNRA-Typ. g Der Tetraloop vom UNCG-Typ, wie in der vorherigen NMR-Struktur der isolierten sD-Subdomäne von CVB3 5′CL38 beobachtet. Die schwarzen gestrichelten Linien (a), (b) und (e) stellen Heteroatome innerhalb von Wasserstoffbrückenbindungsabständen dar. Das graue Netz in (c) und (d) stellt die 2|Fo | dar - |Fc | Elektronendichtekarte auf Konturebene 1σ und Schnitzradius 1,8 Å.

Um die beobachteten Strukturmerkmale der sD-Subdomäne mit zuvor berichteten NMR-Modellen zu vergleichen, haben wir die Kristallstruktur der sD-Subdomäne mit den vorherigen NMR-Modellen (Strukturen mit der niedrigsten Energie) von sDs für CVB3 und einer enteroviralen Konsensussequenz überlagert (Abb. 3c, RMSDs = 1,947). Å bzw. 3,461 Å)37,38. Während wir einige Unterschiede in den L4-Strukturen der Ausbuchtung und der Schleife beobachteten, waren die Strukturen der Py-Py-Helix sehr ähnlich (Abb. 3d, RMSDs = 0,430 Å bzw. 1,266 Å). Interessanterweise zeigte die Konsens-sD-Struktur im Gegensatz zu unserer Kristallstruktur umgeklapptes U49 und helikal gestapeltes A50. Diese Konfiguration ermöglicht die Bildung eines H-Brückennetzwerks mit C48, U49, A50 und G77, einschließlich eines Basendreifachs A50·C48-G77 anstelle des in der Kristallstruktur beobachteten U49·G51-C78 (ergänzende Abbildung 12). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung haben frühere Studien mit zellfreien Systemen gezeigt, dass eine einzelne Nukleotidausbuchtung für die (-)-Strang-Synthese ausreicht14,20. Es kann jede Konfiguration existieren, oder die gesamte Vier-Wege-Verbindungsfaltung des CVB3 5′CL2a begünstigt die in der Kristallstruktur beobachtete Ausbuchtungskonfiguration, da das NMR-Modell für eine isolierte sD-Subdomäne abgeleitet wurde. Wir haben das CVB3-sD-NMR-Modell für diesen Vergleich ausgeschlossen, da dieses Modell die Sequenz erst nach der Ausbuchtung enthielt. Als nächstes haben wir die Breite der Hauptfurche innerhalb der P4-Helix gemessen (Abb. 3e). Der gemessene durchschnittliche Abstand zwischen Pi (ausgehend von G47) und Pi+6 über die P4-Helix beträgt 11,5 ± 2,9 Å, was mit der großen Furchenbreite übereinstimmt, die für viele andere RNA-Kristallstrukturen beobachtet wurde (11,1 ± 2,2 Å)58. Die gemessene Hauptfurchenbreite für die P2-Helix der Unterdomäne B in unserer Kristallstruktur ähnelt auch der der P4-Helix (11,6 ± 1,4 Å), was darauf hindeutet, dass sowohl die P2- als auch die P4-Helices keine signifikanten Abweichungen in den Hauptfurchenbreiten aufweisen , was den vorherigen Behauptungen widerspricht, die auf den NMR-Modellen der sD- und sB-Helices basieren, dass beide eine verbreiterte Hauptfurche aufweisen, um Interaktionsstellen für die entsprechende Proteinbindung bereitzustellen. Die durchschnittliche Breite der großen Furche für die vorherigen NMR-basierten Strukturen beträgt 15,7 ± 4,7 Å58, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass die für die sB- und sD-Helices vorgeschlagenen erweiterten Hauptfurchenbreiten auf einige Unklarheiten im Zusammenhang mit der NMR-Modellierung zurückzuführen sind.

Frühere biochemische und NMR-Studien haben gezeigt, dass die sD-Schleife für die virale 3Cpro-Bindung erforderlich und ausreichend ist14,20,36,37,38. Da CVB3 3Cpro promiskuitiv an sD-Subdomänen anderer Enteroviren mit Tetraloops bindet, jedoch nicht an RVB14 sD mit einem Triloop bindet20, deuten diese Studien auch darauf hin, dass 3Cpro das gesamte Strukturmerkmal innerhalb des sD-Loops und nicht eine definierte Sequenz erkennt20,37,38. Allerdings untersuchte keine dieser früheren Studien die Auswirkungen einer hochkonservierten G66-Mutation auf die 3Cpro-Bindung. Unsere mit einer Auflösung von 1,9 Å gelöste CVB3 5′CL2a-Struktur enthält eine G66C-Mutation. Das Konstrukt mit der Wildtyp-sD-Schleife erzeugte Kristalle, die jedoch nur mit einer Auflösung von ~8 Å beugten, was darauf hindeutet, dass diese Mutation für eine robuste Kristallisation notwendig war. Interessanter ist, dass diese einzelne Mutation für die Gesamtkonformation des sD-Tetraloops wichtig zu sein scheint. Während die L4-Schleife, 5′-auCACCgu-3′, innerhalb der sD-Subdomäne unserer Kristallstruktur eine Tetraloop-Faltung vom Typ GNRA (N = jedes Nukleotid; R = A oder G) annimmt (Abb. 3f), wurden frühere NMR-Studien mit CVB3 durchgeführt Die sD-Subdomäne und ein enteroviraler Konsens haben gezeigt, dass die WT-sD-Schleife 5′-auCACGgu-3′ eine Tetraloop-Faltung vom UNCG-Typ (N = jedes Nukleotid) annimmt (Abb. 3g) 36, 37. Dies bedeutet, dass die sD-Loop-Sequenz, insbesondere das vierte Nukleotid in der Schleife, auch für die Aufrechterhaltung einer spezifischen Tetraloop-Konformation des sD-Loops von entscheidender Bedeutung ist, was mit der hohen Konservierung von G66 in den enteroviralen 5′CLs übereinstimmt. Dementsprechend wurde gezeigt, dass die Insertion von G als viertes Nukleotid des RVB14 sD-Triloops zur Bildung eines Tetraloops dessen Bindung an CVB3 3Cpro auf ein ähnliches Niveau wie bei CVB3 5′CL20 wiederherstellt.

Um die strukturellen Grundlagen der 3Cpro-Bindung mit dem 5′CL zu verstehen und die funktionelle Relevanz unserer Kristallstruktur zu validieren, haben wir die Bindung eines rekombinanten CVB3 3Cpro mit unseren RNA-Kristallisationskonstrukten getestet. Basierend auf früheren Studien61 haben wir das katalytische Cystein (C147) des 3Cpro zu Alanin mutiert, um dessen potenzielle Proteaseaktivität zu vermeiden. Die ITC-Assays zeigten, dass CVB3 3Cpro die WT- und 5′CL2-Konstrukte mit ähnlichen Affinitäten bindet (offensichtlicher Kd = 1,40 ± 0,14 µM bzw. 1,30 ± 0,09 µM), was darauf hindeutet, dass das Pfropfen der Fab-Bindungssequenz in die sB-Schleife fast keine Wirkung hatte auf der 3Cpro-Bindung mit der sD-Schleife (Abb. 4a, b; Einzelheiten siehe ergänzende Abb. 13). Das 5′CL4-Konstrukt, bei dem die sD-Schleife durch die Fab-bindende Pentaschleife ersetzt wurde, zeigte eine viel schwächere Affinität (scheinbarer Kd = 9,4 ± 3,0 µM im Vergleich zu 1,40 ± 0,14 µM für das 5′CL2), was darauf hindeutet, dass 3Cpro die sD-Schleife spezifisch erkennt innerhalb des CVB3 5'CL (Abb. 4b; siehe ergänzende Details zu Abb. 13). Bemerkenswerterweise zeigte das 5'CL2a-Kristallisationskonstrukt, das eine G66C-Mutation innerhalb der sD-Schleife enthielt, im Vergleich zu 5'CL2-RNA eine viel schwächere Bindung mit dem 3Cpro (scheinbarer Kd = 17,0 ± 8,0 µM, Abb. 4b; siehe ergänzende Abb. 13). für Details), was auf eine entscheidende Rolle von G66 bei der 3Cpro-Proteinerkennung schließen lässt. Die relative Positionierung von G66 im UNCG-Typ und C66 im GNRA-Tetraloop ist jedoch ähnlich (ergänzende Abbildung 4), was darauf hinweist, dass die Tetraloop-Konformation über die sequenzspezifischen Wechselwirkungen hinaus eine wichtige Rolle bei der 3Cpro-Bindung spielt. Zusammengenommen belegen diese Analysen, dass 3Cpro einen Tetraloop vom UNCG-Typ innerhalb der sD-Schleife erkennt und alle Mutationen, die Veränderungen an dieser Struktur verursachen, die Bindung von 3Cpro an die enteroviralen 5′CLs aufheben.

ein repräsentatives ITC-Profil für den WT 5′CL. Die Wärme wird bei aufeinanderfolgenden Injektionen von 2 µl CVB3 3C (~400 µM) in die RNA-Lösung (~10 µM) in der Kalorimetriezelle freigesetzt. b, c Die Bindungskurven aus den ITC-Daten für die Bindung des 3C mit verschiedenen Kristallisations-RNA-Konstrukten (Einzelheiten siehe ergänzende Abbildungen 13, 14 und 15). d Struktur des CVB3 5′CL2a, die die tertiären Wechselwirkungen zwischen den sC- und sD-Subdomänen zeigt, insbesondere das Andocken der sC-Schleife A40 in die Py-Py-Region der P4-Helix innerhalb der sD-Subdomäne. e Die Details der tertiären Wechselwirkungen vom A-Minor-Typ zwischen dem A40- und dem C56·U73-Basenpaar innerhalb der Py-Py-Region. f Ein A40U-Mutationsmodell, das eine Störung der A-Minor-Wechselwirkungen zwischen der sC-Schleife und der Py-Py-Helix zeigt. g Die Bindungskurven aus den ITC-Daten für die Bindung des 3C mit der A40U-Mutante des übergeordneten 5′CL2-Konstrukts. Schwarze gestrichelte Linien in (d), (e) und (f) stellen Heteroatome innerhalb von Wasserstoffbrückenbindungsabständen dar. Das graue Netz in d und e stellt das 2|Fo | dar - |Fc | Elektronendichtekarte auf Konturebene 1σ und Schnitzradius 1,8 Å.

Obwohl die sD-Loop-Mutanten eine verringerte Affinität zu 3Cpro zeigten, deuten die beobachtbaren Affinitäten dieser Mutanten auf zusätzliche Kontakte von 3Cpro mit dem 5′CL hin. Um diese Hypothese zu testen, führten wir 3Cpro-Bindungsstudien mit den Dinukleotid-Bulge- und Py-Py-Mutanten durch. Die Eliminierung der Dinukleotidausbuchtung durch Zugabe der komplementären Nukleotide (5'CL-sD-NB, ergänzende Abbildung 14) zeigte eine etwa siebenmal geringere Affinität (scheinbares Kd = 10,1 ± 2 µM, Abbildung 4c) mit 3Cpro im Vergleich zu WT 5'CL (scheinbarer Kd = 1,4 ± 0,14 µM, ergänzende Abbildung 14), was auf direkte Kontakte der Bulge-Nukleotide mit dem 3Cpro hinweist. Ein Konstrukt (5'CL-sD-CN, ergänzende Abb. 14), bei dem die Py-Py-Region durch die kanonischen Basenpaare ersetzt wurde, zeigt jedoch eine ähnliche Affinität (scheinbares Kd = 3,4 ± 0,7 µM, Abb. 4c) wie das WT 5 ′CL, was darauf hindeutet, dass die Py-Py-Region weniger wahrscheinlich direkt an der 3Cpro-Bindung beteiligt ist. Darüber hinaus bindet eine isolierte sD-Subdomäne (sDi, ergänzende Abbildung 15) im Einklang mit den vorherigen Berichten 3Cpro mit einer ähnlichen Affinität (scheinbarer Kd = 2,1 ± 0,12 µM, Abbildung 4c) wie das intakte WT 5'CL, was darauf hindeutet, dass die Die sD-Subdomäne reicht für die 3Cpro-Bindung durch spezifische Wechselwirkungen der sD-Schleife und der sD-Ausbuchtung aus. Darüber hinaus wurden 3Cpro-Bindungsstudien mit isolierten sD-Konstrukten mit der kanonischen Basenpaarung von U49A50 (sDi-NB, scheinbarer Kd = 5 ± 0,1 µM), nur U49 (sDi-U49P, scheinbarer Kd = 4,9 ± 0,87 µM) oder nur A50 durchgeführt (sDi-A50P, scheinbarer Kd = 3,5 ± 0,6 µM) weisen darauf hin, dass die Gesamtstruktur der Ausbuchtung für die 3Cpro-Bindung entscheidend ist und nicht die Identität des ausgebuchteten Nukleotids (siehe ergänzende Abbildung 15 für die Konstrukte und ITC-Daten). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit zwei unterschiedlichen Konformationen der Ausbuchtung, die im vorherigen NMR37 und unseren Kristallstrukturen beobachtet wurden, und In-vitro-Replikationsstudien, die zeigten, dass sowohl U49A50, aber nicht U49 oder A50 gelöscht wurden oder ihre Positionen vertauscht wurden, wodurch die (-)-Strang-Synthese aufgehoben wurde14 ,20.

Unsere Kristallstruktur des CVB3 5'CL voller Länge zeigte umfangreiche tertiäre Wechselwirkungen zwischen den sC- und sD-Subdomänen, einschließlich beispielloser Wechselwirkungen zwischen der L3-Schleife und der P4-Helix-Py-Py-basierten gepaarten Region. Erstens interagieren die P3- und P4-Helix-Rückgrate über ein Netzwerk direkter und wasservermittelter Wasserstoffbrückenbindungen (Abb. 4d). Die Phosphatsauerstoffe G75 und U74 bilden direkte Wasserstoffbrückenbindungen mit den 2′OH-Gruppen von G44 bzw. C38. Die G75-Phosphatsauerstoffe sind auch an wasservermittelten Wasserstoffbrückenbindungen mit den G44 N3-, 2′OH- und Aminogruppen beteiligt. Neben diesen Kontakten zwischen sC- und sD-Subdomänen zeigte unsere Kristallstruktur interessanterweise, dass die L3-Schleife A40 durch die A-Minor-Wechselwirkungen in die kleine Furche der Py-Py-Helix andockt (Abb. 4e). Das A40 kontaktiert C56 und U73 über Watson-Crick-Sugar-Edge- und Hoogsteen-Sugar-Edge-Wasserstoffbrückenwechselwirkungen und bildet ein A40·C56·U73-Basentripel. Insbesondere interagieren die 2'OH-Gruppen C56 und U73 mit A40 N1 bzw. N7 und ihre O2s mit der A40-Aminogruppe über direkte Wasserstoffbrückenbindungen (Abb. 4e). Um dieses Andocken des A40 in Lösung zu validieren, führten wir NMR-Studien für das 5′CL2-Konstrukt durch. Durch die Anwendung verschiedener Variationen von A2RU6R-Markierungsschemata (siehe Methoden) beobachteten wir NOE-Signale (Nuclear Overhauser Effect) zwischen den A40 H2 und H1s von zwei Uracils (ergänzende Abbildung 16), was mit den A40- und Py-Py-Wechselwirkungen in übereinstimmt unsere Kristallstruktur, in der die H1' von U57 und U74 nahe an H2 von A40 liegen (<4 Å, ergänzende Abbildung 16).

Die zweiwertigen Kationen wie Mg2+ stabilisieren bekanntermaßen die RNA-Tertiärstrukturen. Dennoch veränderte die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mg2+ in der Lösung die Bindungsaffinitäten von 3Cpro mit den 5′CL-Konstrukten nicht wesentlich (für 5′CL2, scheinbarer Kd mit 10 mM Mg2+ = 1,4 ± 0,2 µM im Vergleich zu 1,30 ± 0,09 µM). in einer Mg2+-dialysierten Lösung), was darauf hindeutet, dass die Tertiärstrukturen mit großer Reichweite im Vergleich zu den Sekundärstrukturmerkmalen innerhalb der 5'CL möglicherweise keinen wesentlichen Einfluss auf die 3Cpro-Bindung haben. Bemerkenswert ist, dass die 1D- und 2D-NMR-Spektren für das CVB3 5′CL2a-Konstrukt in einer Lösung mit 5 mM Mg2+ und einer mit Mg2+ dialysierten Lösung nahezu überlagerbar sind (ergänzende Abbildung 17). Es werden nur kleine salzabhängige chemische Verschiebungen, aber keine größeren Verschiebungen oder Änderungen der Peakintensität aufgrund größerer Strukturänderungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich CVB3 5′CL im Gegensatz zum RVB14 5′CL20 in den kompakten H-Typ faltet 4-Wege-Verbindung unabhängig vom Mg2+ in der Lösung. In Übereinstimmung mit den NMR-Ergebnissen beobachteten wir selbst bei einer Auflösung von 1,9 Å keine auffälligen Mg2+-Bindungsstellen in der Kristallstruktur, obwohl die Kristallisationsbedingungen mindestens 10 mM Mg2+ enthielten.

Die weitreichenden Wechselwirkungen zwischen hochkonservierten A40- und Py-Py-Nukleotiden zwischen enteroviralen 5'CLs legen nahe, dass diese Nukleotide möglicherweise eine wichtige Rolle für die 3Cpro-Bindung mit der 5'CL-Struktur spielen. Vorhersehbar würde die A40- oder Py-Py-Mutation die 5'CL-Tertiärstruktur destabilisieren (siehe Abb. 4f) und die Bindungsaffinität von 3Cpro verringern. Allerdings hatte die A40U-Mutation innerhalb der sC-Triloop von CVB3 5′CL2 nur geringe Auswirkungen auf die 5′CL-Bindung mit 3Cpro (offensichtlicher Kd = 3,10 ± 0,22 µM im Vergleich zu Kd = 1,40 ± 0,14 µM für 5′CL2 (Abb. 4g; ergänzende Abb. 14). Diese leichte Abnahme der Affinität für die A40U-Mutante kann jedoch auf geringfügige Konformationsänderungen innerhalb der 5'CL-Struktur zurückzuführen sein, die durch diese A40U-Mutation hervorgerufen werden (siehe Abb. 4f). Diese Ergebnisse stimmen auch mit überein unsere ITC-Messungen für intaktes Wildtyp-5'CL und eine isolierte sD-Subdomäne für die 3Cpro-Bindung (scheinbares Kd = 1,4 ± 0,14 µM bzw. 2,10 ± 0,12 µM; Abb. 4b, c, ergänzende Abb. 13 und 15), as sowie zuvor berichtete Affinitäten dieser RNA-Konstrukte für 3Cpro basierend auf einem Filterbindungsassay (scheinbarer Kd = 2,7 bzw. 4,6 µM)20, was bestätigt, dass die A40-Wechselwirkungen keine direkte Rolle bei der Bindung von 3Cpro spielen. In ähnlicher Weise bindet 3Cpro Das Wildtyp-5'CL und das 5'CL-sD-CN (das durch kanonische Paare ersetzte Py-Py) sind ähnlich aufgebaut (Abb. 4c; Ergänzende Abbildungen. 14 und 15), im Einklang mit der vorherigen Beobachtung, dass der Ersatz der Py-Py-Helix durch kanonische Basenpaare die (-)-Strang-Synthese nicht aufhob14. Wie jedoch in einem Hefe-Drei-Hybrid-Assay gezeigt wurde, wurde die Deletion von U74 aufgehoben, aber die kompensatorische C56U-Mutation bewahrte immer noch die 3Cpro-Bindung mit dem 5'CL20. Wenn wir unsere strukturellen und 3Cpro-Bindungsergebnisse zusammenfassen, ist es offensichtlich, dass die Integrität der Dinukleotidausbuchtung und der Schleife, die die Gesamtstruktur der sD-Subdomäne bewahren, für eine effektive 3Cpro-Bindung erforderlich ist und dass die tertiären A40U-Py-Py-Wechselwirkungen darüber hinausgehende Konsequenzen haben die 3Cpro-Bindung.

Wir vermuteten, dass eine wichtigere strukturelle Rolle dieser Wechselwirkungen darin besteht, die 4-Wege-Verbindung des 5′CL zu stabilisieren, die die 3Cpro-Bindungsstelle (sD-Schleife) von der PCBP-Bindungsstelle des Wirts (sB-Schleife) entfernt positioniert, um mögliche sterische Konflikte zu vermeiden zwischen 3Cpro und PCBP während der Montage der Replikationsmaschinerie. Um diese Hypothese zu testen, haben wir das menschliche PCBP2-Protein in voller Länge rekombinant exprimiert und gereinigt und die Bindungstests mittels Gelelektrophorese durchgeführt (ergänzende Abbildung 18). Da gezeigt wurde, dass PCBP2 sowohl die sB-Schleife als auch die C-reiche Spacer-Region zwischen 5'CL und IRES bindet, haben wir auch Bindungstests mit den längeren RNA-Konstrukten durchgeführt, die sowohl die 5'CL- als auch die Spacer-Region enthalten. In Übereinstimmung mit den vorherigen Studien, dass PCBP2 die sB-Schleife erkennt, beobachteten wir, dass der WT 5'CL, aber nicht die sB-Schleifenmutante 5'CL2 PCBP2 bindet. Interessanterweise interagiert die A40U-Mutante, die keinen Einfluss auf die 3Cpro-Bindung hatte, mit PCBP2 mit viel geringerer Affinität als die WT-5′CL, was darauf hindeutet, dass die A40-Py-Py-Wechselwirkung eine gewisse Rolle bei der PCBP2-Bindung an 5′CL spielt Struktur. Bemerkenswert ist, dass das längere RNA-Konstrukt 5′CLWTSP mit der sB-Schleife und der Spacer-Sequenz das PCBP2 im Vergleich zum 5′CL ohne Spacer fest bindet, was darauf hindeutet, dass die sB-Schleife und die Spacer-Sequenz nahe beieinander liegen, was mit dem übereinstimmt beobachtete das Nebeneinander von sA- und sB-Subdomänen in unserer Kristallstruktur. Obwohl die Auswirkung der A40-Py-Py-Wechselwirkung auf die PCBP2-Bindung und die 5'CL-Funktion noch gründlich untersucht werden muss, deuten unsere vorläufigen Ergebnisse darauf hin, dass die H-förmige 5'CL-Struktur diese A40-Py-Py-Kontaktgegenüberstellung über große Entfernungen stabilisiert hat die PCBP2-Bindungsstellen, die sB-Schleife und der von der 3Cpro-Bindungsstelle gut getrennte Spacer, die sD-Subdomäne.

Um die strukturelle Relevanz der Nukleotide in enteroviralen 5′CLs zu untersuchen, führten wir eine phylogenetische Analyse mit bioinformatischen Werkzeugen durch. Das Alignment von über 5000 enteroviralen Genomsequenzen zeigt einen hohen Grad an Sequenzkonservierung innerhalb der 5'CLs-Region (ergänzende Abbildung 19). Die berechnete Konsens-Sekundärstruktur (Abb. 5a; ergänzende Abb. 20) aus diesen Sequenzausrichtungen für sieben enterovirale Genotypen unter Verwendung von R-Scape62 zeigt, dass die Strukturmerkmale innerhalb jeder Subdomäne sA, sB, sC und sD hoch konserviert sind, was mit dem übereinstimmt zuvor vorgeschlagene Konsens-Sekundärstruktur des enteroviralen 5'CL in der Rfam-Datenbank63, erhalten durch Alignment von 162 Sequenzen von nur 87 Enterovirus-Arten. Bemerkenswert ist, dass die in unserer CVB3 5'CL-Kristallstruktur beobachteten Schlüsselnukleotide, einschließlich der A40-, Py-Py- und sD-Ausbuchtung, absolut konserviert sind, was darauf hindeutet, dass das Virus diese Nukleotide einem starken Selektionsdruck standhalten muss. Interessanterweise sagt die für R-Scape62 optimierte Konsensus-Sekundärstruktur voraus, dass die sC-Subdomäne eine Helix aus vier Basenpaaren ist, die durch einen Triloop geschlossen wird, wobei das absolut konservierte A40 das dritte Nukleotid innerhalb des Triloops ist. In ähnlicher Weise enthält die sD-Subdomäne eine hochkonservierte 6-Basenpaar-Helix zwischen der Vier-Wege-Verbindung und der Py-Py-Basenpaarregion. Die Helix wird außerdem durch eine zweit lange Ausbuchtung zwischen dem 2. und 3. Basenpaar im Anschluss an die Vier-Wege-Verbindung unterbrochen. Die Längen- und Sekundärstrukturerhaltung innerhalb der sC- und sD-Subdomänen (ergänzende Abbildung 21) mit dieser spezifischen Anordnung ist möglicherweise erforderlich, um die spezifischen Wechselwirkungen zwischen der L3-Schleife und der Py-Py-basierten gepaarten Region im Einklang mit den beobachteten tertiären Wechselwirkungen aufrechtzuerhalten in unserer Kristallstruktur.

a Vorgeschlagenes sekundäres Strukturmodell des enteroviralen 5'CL-Konsensus (siehe auch ergänzende Abbildung 20 für Einzelheiten). Die 5′CLs sind eines der am stärksten konservierten RNA-Elemente unter Enteroviren (b). Die dreidimensionale Konsensusfaltung der 5′CLs in enteroviralen Genomen basiert auf der Kristallstruktur von CVB3 5′CL und zeigt Bindungsmodi von viralem 3CD und Wirts-PCBP Proteine. Die roten gestrichelten Linien stellen tertiäre Wechselwirkungen dar und zeigen die koaxiale Stapelung der entsprechenden Subdomänen.

Bei der enteroviralen Genomreplikation gibt es zwei unterschiedliche Schritte. Die erste ist die Synthese von (-)-Strang-RNA unter Verwendung der genomischen RNA als Matrize, und die zweite ist die Rücksynthese der (+)-Strang-genomischen RNA unter Verwendung der neu hergestellten (-)-Strang-RNA als Matrize. Der 5′CL ist einer der Hauptbestandteile der enteroviralen Genomreplikationsmaschinerie, der virale und zelluläre Proteinfaktoren direkt bindet, um einen replikationskompetenten RNP-Komplex zu bilden. Die sD-Subdomäne von 5′CL interagiert über ihr 3Cpro mit dem viralen 3CD-Fusionsprotein, das die virale Polymerase Dpol zur Replikationsinitiationsstelle bringt. Die sB-Subdomäne bindet PCBP2, das dann mit dem PABP-Poly(A)-Schwanzkomplex am 3′-Ende interagiert, um das virale Genom zu zirkulieren. Die 3CD interagiert auch mit cre, einer Stammschleifen-RNA-Domäne, die sich innerhalb der 2C-kodierenden Region befindet, um die Uridylierung des viralen VPg-Proteins zu fördern. Das resultierende VPg-pUpU dient dann als Primer für die (-)-Strang-RNA-Synthese durch aktive Dpol-Polymerase, ein Autospaltungsprodukt des 3CD-Vorläufers. Darüber hinaus beeinflussen die konservierte RNA-Sequenz und die Strukturmerkmale im 5'CL die VPg-Uridylierung und die Stabilität des viralen Genoms und können die Replikationsmaschinerie bei der Erkennung des enteroviralen Genoms in einem Milieu unzähliger zellulärer RNAs unterstützen64. Daher liefern die hochauflösenden Strukturen der 5′CLs und der entsprechenden RNP-Komplexe mit 3C oder 3CD und PCPB wichtige Informationen nicht nur für ein detailliertes Verständnis der Mechanismen der enteroviralen Genomreplikation – einem kaum verstandenen virologischen Prozess –, sondern auch für die Entwicklung von Arzneimitteln die auf diese Plattform abzielen. Obwohl frühere virologische, molekularbiologische, biochemische und biophysikalische Ansätze ein gewisses strukturelles und funktionelles Verständnis der 5'CLs für die Initiierung der enteroviralen Genomreplikation und der Interaktion ihrer Subdomänen mit den 3C- oder 3CD- und PCPB-Proteinen auf molekularer Ebene ermöglicht haben36,37,38, 39,40,41,42,43,44, unsere CVB3 5'CL-Kristallstruktur stellt die erste hochauflösende Struktur eines intakten 5'CL eines Enterovirus dar und bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen zum 5'CL-vermittelten enterovirale Replikationsmechanismen.

Die gesamten Sekundärstrukturen der CVB3- und RVB14-5′CLs, einschließlich der NMR-abgeleiteten Modelle für die isolierten sC- und sD-Subdomänen, sind nahezu identisch. Die dreidimensionale Architektur unserer CVB3 5′CL-Kristallstruktur unterscheidet sich jedoch erheblich von der der RVB14 5′CL-Modelle. Im Gegensatz zum RVB14 5'CL-Modell43 verwendet unsere Kristallstruktur einen 4-Wege-Übergang vom H-Typ mit den koaxial gestapelten sA-sD- und sB-sD-Subdomänen, wobei sA mit sB und sC mit sD gegenübergestellt werden. Diese Diskrepanzen hängen möglicherweise mit der geringen Auflösung der SAXS-Technik und der rechnerischen Modellierung der intakten 5′CL-Struktur zusammen, die ausschließlich auf den NMR-Strukturen isolierter sB- und sD-Subdomänen basiert, ohne die Strukturen der sA- und sC-Subdomänen zu berücksichtigen. Mithilfe der NMR- und SAXS-Ansätze haben Warden et al. 43 schlugen zuvor die Mg2+-abhängigen Strukturmodelle für das RVB14 5′CL voller Länge vor. Ohne Mg2+ nahm der RVB14 5′CL eine erweiterte Konformation an, die einer 4-Wege-Verbindung vom cK-Typ ähnelte, wobei die sB- und sD-Subdomänen nahezu senkrecht zueinander standen, aber mit Mg2+ faltete sich dieselbe RNA in einer kompakteren Konformation das die Subdomänen sB und sD gegenüberstellte. Darüber hinaus zeigte RVB14 5′CL eine wesentliche Änderung der chemischen NMR-Verschiebungen für die an der Py-Py-Helix beteiligten Nukleotide nach Zugabe von Mg2+43, was nicht mit dem übereinstimmte, was für die gleiche sD-Subdomäne isoliert beobachtet wurde40. Diese Beobachtungen stimmen jedoch mit der Stabilisierung der Py-Py-Region durch tertiäre Wechselwirkungen mit der Schleife L2 überein, wie sie in unserer intakten CVB3 5'CL-Kristallstruktur beobachtet wird. Obwohl die Mg2+-abhängigen Konformationen verschiedener enteroviraler 5′CLs im Gegensatz zu früheren Ergebnissen mit RVB14 noch im Detail untersucht werden müssen, belegen unsere vorläufigen NMR-Ergebnisse, dass sich die CVB3 5′CL unabhängig von Mg2+ zu einer kompakten 4-Wege-Verbindungsstruktur vom H-Typ faltet in der Lösung, was auf die unterschiedliche Rolle von Mg2+ bei der Stabilisierung verschiedener enteroviraler 5′CLs schließen lässt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Wirksamkeit der enteroviralen Genomreplikation von den Interaktionsstellen für PCBP und 3C- oder 3CD-Proteine ​​innerhalb der 5′CL-Struktur abhängt. Die sD-Subdomäne ist für die 3C-Bindung erforderlich und ausreichend. Folglich sind die Bulge-, Py-Py-Region- und Tetraloop-Strukturen die am stärksten konservierten Regionen innerhalb der sD-Subdomäne, die sowohl die (+)- als auch die (-)-Strang-RNA-Synthese erheblich beeinflussen. Bei CVB3 hemmte die Deletion der Dinukleotid-Ausbuchtung U49A50 die (-)-Strang-Synthese, aber Mutationen A49U50 zum Austausch dieser Nukleotidpositionen und die Deletion des U49- oder A50-Nukleotids hatten fast keine Wirkung, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Nukleotid-Ausbuchtung für die (-)-Strang-Synthese ausreicht. -)-Strang-Synthese. Allerdings erforderte die (+)-Strang-Synthese eine intakte Dinukleotid-Ausbuchtung. Während die Deletion von U74 innerhalb der Py-Py-Helix die 3C-Bindung mit dem 5′CL aufhob, stützten frühere NMR-Daten keine direkten Wechselwirkungen des Proteins mit den Nukleotiden in der Py-Py-Region. Durch den Ersatz des C56·U73-Paares durch das U56·U73-Paar blieb jedoch die 3C-Bindung mit dem 5′CL erhalten. Weitere Studien mit zellfreien Assays für PV und CVB3 zeigten, dass die vollständige Eliminierung der Py-Py-Fehlpaarung mit Watson-Crick-Basenpaaren die (-)-Strang-Synthese erhöhte und gleichzeitig die (+)-Strang-Synthese verringerte, was darauf hindeutet, dass die Py-Py Die Region in der sD-Subdomäne ist wichtig, um das Verhältnis von (-) und (+) RNA-Strängen während einer Virusinfektion aufrechtzuerhalten. Strukturell behält die Py-Py-Region eine A-Form-Helizität bei. Alle Mutationen, die die A-Form-Helizität nicht verändern, würden immer noch die A-Minor-Wechselwirkungen zwischen der sC-Schleife und der Py-Py-Region zulassen, aber ein ähnliches Szenario ist weniger wahrscheinlich in einer analogen Struktur am 3′-Ende des (-)-Strangs. Möglicherweise ist der Bedarf an der Py-Py-Region im 5'CL bei der (+)-Strang-Synthese unter Verwendung einer (-)-Strang-RNA-Matrize stärker ausgeprägt. Es würde den Rahmen dieser Studie sprengen, die Strukturen der analogen RNA-Strukturen zu untersuchen, die am 3′-Ende der (-)-Strang-RNA gebildet werden, aber unsere Kristallstruktur unterstützt, dass die Py-Py-Region die gesamte 5′CL-Struktur stabilisiert durch tertiäre Wechselwirkungen mit der sC-Schleife. Außerdem zeigt die isolierte sD-Subdomäne eine ähnliche Bindungsaffinität wie das intakte CVB3 5′CL, was darauf hindeutet, dass die absolut konservierten Strukturmerkmale in der sD-Subdomäne bei Enteroviren über die Bindung des 3C-Proteins hinaus wichtig sind. Obwohl die Auswirkungen von sC-Loop-Mutationen, einschließlich A40, auf die (-)- und (+)-Strang-Synthese noch untersucht werden müssen, unterstreicht die absolute Erhaltung des A40 gegenüber starkem Selektionsdruck darüber hinaus seine Notwendigkeit, deren Integrität aufrechtzuerhalten tertiäre Interaktionen für die virale Genomreplikation.

Ein Vergleich unserer CVB3 5'CL-Struktur mit anderen Enteroviren und Rhinoviren legt nahe, dass die Längen der P3-Helix (vier Basenpaare) und der P4-Helix vor der Py-Py-Region (sechs Basenpaare, unterbrochen durch die Dinukleotid-Ausbuchtung) sind am besten erhaltene Strukturmerkmale. Diese Merkmale unterstreichen eine besondere Anforderung an die Positionierung der A40- und Py-Py-Paare, um tertiäre Interaktionen zwischen den sC- und sD-Subdomänen zu erleichtern. Diese tertiären Wechselwirkungen innerhalb des 5′CL sind stärker ausgeprägt, wenn man die PCBP-Bindungsstellen berücksichtigt. Innerhalb der enteroviralen 5′CL interagiert PCBP mit der sB-Schleife und einer C-reichen Spacersequenz am Ende der 5′CL-Struktur, wobei die spätere Sequenz stärker zu den Bindungsinteraktionen beiträgt. Die Mutationen zu C-reichen Sequenzen innerhalb der Subdomäne B und der Spacer-Region heben die PCBP-Bindung auf und verschlechtern die (-)-Strang-RNA-Synthese, was bestätigt, dass die PCBP-Bindung in diesen Regionen für eine effiziente Replikation des enteroviralen Genoms von entscheidender Bedeutung ist19,27,28. Im Gegensatz zu zuvor vorgeschlagenen Modellen von RVB14 5′CL mit der Nebeneinanderstellung von sD- und sB-Subdomänen zeigte unsere Kristallstruktur von CVB3 5′CL die Nebeneinanderstellung von sA- und sB-Subdomänen, wodurch die sB-Schleife und die C-reiche Spacersequenz nahe beieinander liegen (Abb. 5b), was mit unseren vorläufigen Bindungsstudien mit menschlichem PCBP2 übereinstimmt und diese früheren biochemischen Beobachtungen stützt. Daher spielen die tertiären Wechselwirkungen zwischen der sC-Schleife und den Py-Py-Regionen eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der 5′CL-Struktur und der präzisen Positionierung der sB- und sD-Schleifen und bieten eine fertige Plattform für die Bindung von Replikationskomponenten und nicht für eine direkte Beteiligung dieser Unterstrukturen mit den 5′CL-Protein-Wechselwirkungen. Weitere Studien zur Bestimmung der hochauflösenden Strukturen enteroviraler 5′CLs im Komplex mit dem entsprechenden viralen Protein 3C oder 3CD und dem Wirtsprotein PCPB2 werden jedoch entscheidende Schritte hin zu einem mechanistischen Verständnis der enteroviralen Replikation und der Entwicklung potenzieller Therapeutika für diese enterovirale Replikationsplattform sein .

RNA-Konstrukte für Kristallisation, Proteinbindung und NMR-Studien wurden durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Eine DNA-Matrize mit einer T7-Promotorsequenz für die Transkriptionsreaktion wurde durch PCR-Amplifikation von ssDNA hergestellt, die von Integrated DNA Technologies erworben wurde. Die ersten beiden Nukleotide des Reverse-Primers wurden 2'-OMe-modifiziert, um die 3'-Ende-Heterogenität des Transkripts zu verringern65. Die RNA wurde 3 Stunden lang bei 37 °C in einem Puffer transkribiert, der 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM DTT, 40 U/ml RNase-Inhibitor, 5 U/ml enthielt TIPPase, 5 mM von jedem NTP, 50 pmol/ml DNA-Matrize und 50 μg/ml hausgemachte T7-RNA-Polymerase66. Die Transkriptionsreaktion wurde durch Zugabe von 10 U/ml DNase I (Promega) und einstündiges Inkubieren bei 37 °C gestoppt. Zur Synthese von NMR-Proben wurde RNA unter Verwendung der markierten NTPs transkribiert, die von Cambridge Isotope Laboratories erworben wurden. Die RNA wurde 8 Stunden lang transkribiert und die Reaktion mit 500 mM Harnstoff und 60 mM EDTA gequencht, gefolgt von 5-minütigem Kochen der Mischung. Alle RNA-Proben wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (dPAGE) gereinigt. Die Bande wurde durch UV-Schattierung sichtbar gemacht, aus dem Gel herausgeschnitten und über Nacht bei 4 °C in 10 mM Tris, pH 8,0, 2 mM EDTA und 300 mM NaCl eluiert. Der Puffer der eluierten RNA wurde dreimal mit reinem Wasser unter Verwendung einer Amicon-Säule mit einem Cut-off von 10 kDa (Millipore Sigma) ausgetauscht. Die RNA wurde gesammelt, in 300-μl-Fraktionen aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80 ° C gelagert. Für die NMR-Proben wurde die RNA durch Ethanolfällung weiter gereinigt, bevor sie lyophilisiert und für die NMR-Messungen gepuffert wurde.

Das Expressionsplasmid Fab BL3-6 war ein freundliches Geschenk von Joseph Piccirilli von der University of Chicago. Das Fab wurde gemäß den veröffentlichten Protokollen52,67,68 gereinigt. Kurz gesagt, das Plasmid wurde in 55244 E. coli-kompetente Zellen transformiert und mit 100 µg/ml Carbenicillin auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen. Zur Beimpfung einer 15-ml-Starterkultur wurden mehrere Kolonien ausgewählt und 8 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Die Starterkultur wurde dann zum Animpfen von 1 Liter 2xYT-Medium verwendet und die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Zur Fab-Überexpression wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 22 °C und 6000 × g zentrifugiert, in 1 Liter phosphatarmem Medium resuspendiert und 24 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 6000 × g geerntet, in PBS, Puffer pH 7,4 mit 0,01 mg/ml Rinderpankreas-DNase I (Sigma-Aldrich) und 400 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert durch Ultraschall lysiert (Qsonica, Cole-Parmer). Die Mischung wurde zunächst bei 40.000 × g zentrifugiert, das klare Lysat wurde durch einen 0,45-Mikron-Filter (VWR) filtriert und das Fab wurde mit dem Bio-Rad NGC Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)-System gereinigt. Zuerst wurde das Lysat durch eine Hi-Trap-Protein-A-Säule (Cytiva) geleitet und das eingefangene Fab mit 0,1 M Essigsäure eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, 10x mit PBS, Puffer pH 7,4 verdünnt und in eine Hi-trap-Protein-G-Säule (Cytiva) geladen. Die eluierten Fab-Fraktionen aus der Protein-G-Säule in 0,1 M Glycin, pH 2,7, wurden gesammelt, 10x mit einem Puffer aus 50 mM NaOAc, 50 mM NaCl, pH 5,5 verdünnt und in eine Hi-Trap-Heparinsäule (Cytiva) geladen. Schließlich wurden die Fab-Fraktionen, die durch die Gradientenelution unter Verwendung von 50 mM NaOAc, 2 M NaCl, Puffer pH 5,5 aus der Heparinsäule eluiert wurden, gesammelt und der Puffer dreimal mit 1x PBS pH 7,4 unter Verwendung einer Amicon-Säule mit 30 kDa Cut-off (Millipore Sigma) ausgetauscht. . Das konzentrierte Fab wurde gesammelt, durch 12 % SDS-PAGE analysiert und mit dem RNaseAlert-Kit (Ambion, www.thermofisher.com) auf RNase-Aktivität getestet. Aliquots (~300 μl) des gereinigten Fab wurden bei –80 °C gelagert.

RNA in Wasser (~100 ng) wurde in einem Puffer rückgefaltet, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2 und 100 mM NaCl enthielt. Die RNA wurde 1 Minute lang auf 90 °C erhitzt und ein entsprechendes Volumen an 10-fachem Rückfaltungspuffer hinzugefügt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 50 °C und anschließend 5 Minuten lang in Eis. Die neu gefaltete RNA wurde dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit verschiedenen Äquivalenten Fab- oder 3 C-Protein inkubiert. Die Protein-RNA-Komplexproben wurden mit einem geeigneten Volumen einer 6x nativen Agarosegel-Beladungslösung, die 30 % Glycerin, jeweils 0,1 % Bromphenolblau und Xylolcyanol enthielt, gemischt. Diese Proben wurden auf 10 % native Polyacrylamidgele geladen und bei 115 V in vorgekühltem 0,5x TBE-Puffer (50 mM Tris-Base, 50 mM Borsäure und 1 mM EDTA, pH 7,5) bei 4 °C laufen gelassen. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid angefärbt und mit dem Geldokumentationssystem Azure 200 (Azure Biosystems) abgebildet.

Die RNA-Probe wurde in einem Faltpuffer, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2 und 100 mM NaCl enthielt, erneut gefaltet. Zuerst wurde RNA in Wasser 1 Minute lang auf 90 °C erhitzt und ein entsprechendes Volumen an 10-fachem Rückfaltungspuffer hinzugefügt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 50 °C und 5 Minuten lang in Eis. Die neu gefaltete RNA wurde dann 30 Minuten lang bei RT mit 1,1 Äquivalenten des Fab inkubiert und unter Verwendung einer Amicon Ultra-1-Säule (Millipore Sigma) mit einem Cut-off von 10 kDa auf 6 mg mL-1 konzentriert. Anschließend wurden Fab-RNA-Komplexe durch Millipore-Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Cut-off von 0,2 μm geleitet (www.emdmillipore.com). Der Flüssigkeitshandhabungsroboter Xtal3 Mosquito (TTP Labtech, ttplabtech.com) wurde verwendet, um hängende Dampfdiffusionskristallisationssiebe bei RT unter Verwendung kommerziell erhältlicher Screening-Kits von Hampton Research und Jena Bioscience einzurichten. Die Kristalle bildeten sich innerhalb einer Woche unter verschiedenen Bedingungen. Ausgewählte Bedingungen wurden hinsichtlich pH-Wert, Fällungsmittel und Salzkonzentration weiter optimiert, um mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit hängenden Tropfen größere Kristalle zu züchten. Die Kristalle erreichten innerhalb einer Woche ihre volle Größe. Zur Kryoprotektion wurden Tropfen mit geeigneten Kristallen auf 30 % Glycerin gebracht, ohne die anderen Zusammensetzungen zu verändern. Nachdem die Kristalle aus den Tropfen herausgefischt worden waren, wurden sie sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur Sammlung der Röntgenbeugungsdaten zum Argonne National Laboratory gebracht.

Die Röntgenbeugungsdatensätze wurden an den Strahllinien 24-ID-C und 24-ID-E des Advanced Photon Source NE-CAT-Abschnitts gesammelt. Alle Datensätze wurden dann mithilfe der automatisierten RAPD-Programme vor Ort (https://rapd.nec.aps.anl.gov/rapd/) integriert und skaliert. Erste Phasen wurden durch molekularen Ersatz mit der zuvor berichteten Struktur von Fab BL3-6 (PDB: 6B14 als Suchmodell unter Verwendung von Phaser auf Phenix69) erhalten. Der iterative Modellaufbau und die Verfeinerung wurden unter Verwendung von COOT70 und dem Phenix-Paket69 durchgeführt. Die RNA wurde eindeutig erstellt von Modellieren der einzelnen Nukleotide in der Elektronendichtekarte, die durch den molekularen Ersatz erhalten wurde. Während der Verfeinerung wurden standardmäßige NCS-Optionen und automatisch ausgewählte TLS-Parameter in Phenix verwendet. Die meisten Wassermoleküle wurden während der Verfeinerungen automatisch von der Phenix-Software bestimmt. Einige Wassermoleküle jedoch wurden manuell für die positive Elektronendichte in der Karte hinzugefügt, basierend auf ihrer Möglichkeit, Wasserstoffbrückenbindungen mit Protein- oder RNA-Resten zu bilden. Die lösungsmittelzugängliche Oberfläche und die Wechselwirkungsfläche wurden mithilfe von (http://www.ebi.ac.uk/) berechnet. pdbe/pisa/)57. Strukturbezogene Abbildungen wurden in PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) erstellt und Abbildungsbeschriftungen wurden in CorelDraw (Corel Corporation, http://www.corel.com) bearbeitet. .

Das rekombinante CVB3 3Cpro wurde unter Verwendung zuvor beschriebener Protokolle mit einigen Modifikationen exprimiert und gereinigt20,38,61. Die Codon-optimierte DNA-Sequenz, die für die CVB3 3Cpro C147A-Mutante kodiert, wurde in den pET-22b(+)-Vektor zwischen NdeI- und XhoI-Restriktionsstellen kloniert (GenScript, https://www.genscript.com). Das exprimierte Protein enthielt die Sequenz MGPAFEFAVA MMKRNSSTVK TEYGEFTMLG IYDRWAVLPR HAKPGPTILM NDQEVGVLDA KELVDKDGTN LELTLLKLNR NEKFRDIRGF LAKEEVEVNE AVLAINTSKF PNMYIPVGQV TEYGFLNLGG TPTKRMLMYN FPTRAGQAGG VLMSTGKVLG IHVGGNGHQG FSAALLKHYF N DEQ mit dem vektorkodierten 6x-His-Tag am C-Terminal. Das Expressionsplasmid wurde in BL21 (DE3) E. coli transformiert und die Zellen wurden in einem 2xYT-Medium, ergänzt mit 100 μg/ml Carbenicillin, bei 37 °C unter Schütteln mit 220 U/min kultiviert, bis eine OD von ~0,6 erreicht war. Anschließend wurden die Zellen mit IPTG (Isopropylthio-β-galactosid) auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zur Proteinexpression induziert, 6 Stunden lang bei 25 °C gezüchtet und schließlich durch Zentrifugation bei 6000 x g geerntet. Die Proteinreinigung wurde in einem Bio-Rad FPLC-System durchgeführt. Das Zellpellet wurde in einem Lysepuffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl und 5 mM Imidazol enthielt, resuspendiert und mittels Ultraschall lysiert. Das Lysat wurde mit 40.000 × g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch einen 0,45-Mikron-Filter geleitet. Das geklärte Lysat wurde dann auf eine HisTrap™-Säule (Cytiva) aufgetragen und das Protein mit einem Puffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 250 mM Imidazol, pH 7,5) von der Säule eluiert, nachdem die Säule mit 5 gewaschen wurde Säulenvolumina des Lysepuffers. Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt, gegen einen Puffer mit 50 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM EDTA und 5 % Glycerin, pH 7,5, dialysiert und durch Größenausschlusschromatographie (HiLoad® 26/600 Superdex® 200 pg) weiter gereinigt Spalte, Cytiva). Die Einzelpeak-Proteinfraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung der Amicon-Zentrifugalfilter (Molekulargewichtsgrenze 10 kDa, Millipore Sigma) konzentriert, mit flüssigem N2 in kleinen Aliquots schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Das menschliche PCBP2 in voller Länge (Reste 11–359) mit C-terminalem 6x-His-Tag wurde unter Verwendung zuvor beschriebener Protokolle mit einigen Modifikationen exprimiert und gereinigt28,71. Kurz gesagt, die Codon-optimierte DNA-Sequenz, die das menschliche PCBP2-Protein kodiert, wurde in den pET-22b(+)-Vektor zwischen NdeI- und XhoI-Restriktionsstellen kloniert (GenScript, https://www.genscript.com). Die Expression und Reinigung erfolgte nach einem ähnlichen Verfahren wie oben für 3Cpro besprochen. Der Lysepuffer enthielt 50 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl und 20 mM Imidazol, wohingegen der Elutionspuffer der HisTrap-Säule 50 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl und 250 mM Imidazol enthielt. Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt, gegen einen Puffer dialysiert, der 50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM KCl, 1 mM EDTA und 5 % Glycerin enthielt, und durch Größenausschlusschromatographie mit HiLoad® 26/600 Superdex® 75 pg weiter gereinigt Spalte. Die Einzelpeak-Proteinfraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung der Amicon-Zentrifugalfilter (Molekulargewichtsgrenze 30 kDa) konzentriert, mit flüssigem N2 in kleinen Aliquots schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die Experimente zur isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) wurden in der MicroCal PEAQ-ITC Automated (Malvern Panalytical)-Ausrüstung unter Verwendung frisch zubereiteter RNA- und Proteinproben durchgeführt. Die RNA- und Proteinproben wurden über Nacht in einen Puffer dialysiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA und 5 % Glycerin enthielt. Die Injektionsspritze enthielt 150 μl ~400 μM 3Cpro-Protein und die Kalorimetriezelle wurde mit 500 μl ~10 μM RNA beladen. Nach thermischer Äquilibrierung bei 25 °C und einer anfänglichen Verzögerung von 60 Sekunden erfolgte eine einzelne Injektion von 200 nl, gefolgt von 19 seriellen Injektionen von 2 μl 3Cpro-Protein in die Kalorimetriezelle. Der angegebene Kd für jedes RNA-Konstrukt stellt die durchschnittliche ± Standardabweichung dar, die aus den dreifachen Experimenten erhalten wurde.

Die RNA-Proben wurden in 100 % D2O (99,8 %, Cambridge Isotope Laboratories) mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 70 mM KCl, 5 mM NaCl und 5 mM MgCl2 (sofern nicht anders beschrieben) in einem 5-ml-Röhrchen bei Konzentrationen gemessen variierend von 0,7 bis 1,2 mM. Die Daten wurden mit einem Bruker AVANCE-Spektrometer (600 MHz, 1H) bei 308 K mit einem gewichteten Probenahmeschema gesammelt72. Nicht austauschbare 1H-Zuordnungen wurden aus 2D-NOESY-Daten erhalten (NOE-Mischzeit = 300 ms, Relaxationsverzögerung = 12,0 s, T = 308 K). Alle NMR-Daten wurden mit NMRFX73 verarbeitet und mit NMRViewJ74 analysiert. Teilzuordnungen wurden unter Verwendung der Standard-NOE-basierten sequentiellen Zuordnungsstrategie75,76 an A2RUR-, U6R- und A2R-markierten RNA-Proben durchgeführt, wobei die Strategien befolgt wurden, die in früheren Studien entwickelt wurden77. Die Zuordnungen wurden durch Vergleiche mit chemischen Verschiebungswerten im NMR-Repository der BioMagResBank unter Verwendung von NMRViewJ78,79,80 validiert. Darüber hinaus wurden frühere Aufgaben verwendet, um einige unserer Aufgaben zu übertragen und zu validieren36,37.

Sofern nicht anders angegeben, wurden Experimente im Zusammenhang mit nativer PAGE, SDS-PAGE und ITC in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Jede Wiederholung führte zu ähnlichen Ergebnissen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die beschriebene Kristallstruktur wurden bei der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 8DP3 hinterlegt. Die Autoren stellen auf Anfrage die Rohdaten, zusätzliche Informationen und Materialien, einschließlich des Plasmids für die Fab BL3-6-Expression, zur Verfügung. Die Anträge sind an DK zu richten

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Diese Arbeit wurde durch Start-up-, SURFF- und START-Auszeichnungen der University of Maryland Baltimore County und den NSF CAREER Award 2236996 an DK und teilweise durch den NIH-Zuschuss T32 GM066706 an NKD unterstützt. Die kristallographische Arbeit basiert auf Forschungen, die am Northeastern durchgeführt wurden Strahllinien des Collaborative Access Team (24-ID-C und 24-ID-E), finanziert vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (P30 GM124165). Der Eiger 16 M-Detektor auf 24-ID-E wird durch einen NIH-ORIP HEI-Zuschuss (S10OD021527) finanziert. Diese Forschung nutzte die Ressourcen der Advanced Photon Source – eine Benutzereinrichtung des Office of Science des US-Energieministeriums (DOE), die vom Argonne National Laboratory unter der Vertragsnummer DE-AC02-06CH11357 für das DOE Office of Science betrieben wird. Die Autoren möchten den Mitarbeitern der Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory für die technische Beratung während der Datenerfassung danken. Wir danken Prof. Michael Summers von der University of Maryland Baltimore County für die freundliche Bereitstellung der NMR- und ITC-Einrichtungen und für die konstruktiven Kommentare zum Manuskript.

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 21250, USA

Naba K. Das, Nele M. Hollmann, Jeff Vogt, Hasan A. Banna, Manju Ojha und Deepak Koirala

Howard Hughes Medical Institute, University of Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 21250, USA

Nele M. Hollmann

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, 21201, USA

Spiridon E. Sevdalis

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NKD und DK konzipierten und gestalteten die Experimente. NKD bereitete die Proben vor, führte die meisten Experimente durch und löste die Kristallstrukturen mit Hilfe von DKNMH, sammelte und analysierte die NMR-Daten. JV führte alle bioinformatischen und rechnerischen Arbeiten durch. SS hat erste Kristallisationsversuche entworfen und aufgebaut. HAB und MO unterstützten NKD bei biochemischen Experimenten und der Erfassung von Röntgenbeugungsdaten. NKD analysierte die meisten biochemischen und kristallographischen Daten und interpretierte die Ergebnisse mit DKNKD und DK verfasste das Manuskript, und alle Autoren überprüften das Manuskript kritisch.

Korrespondenz mit Deepak Koirala.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Benjamin Akiyama und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Das, NK, Hollmann, NM, Vogt, J. et al. Kristallstruktur eines hochkonservierten enteroviralen 5′-Kleeblatt-RNA-Replikationselements. Nat Commun 14, 1955 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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Eingegangen: 28. Juli 2022

Angenommen: 23. März 2023

Veröffentlicht: 07. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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